منصة تصوير خالية من العدسات قابلة للنشر الميداني لتحليل سريع خال من الملصقات لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية

هدفنا هو تقييم وظيفة المناعة بسرعة عن طريق القياس الكمي لتنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية في الوقت الفعلي ، باستخدام تصوير خال من الملصقات وخالي من العدسات لتعزيز المراقبة المناعية. لقد أظهرنا أن مؤشر المناعة الفطرية ، أو I3 ، يميز بشكل موثوق بين نشاط الخلايا القاتلة الطبيعية للمتبرعين الأصحاء والذين يعانون من نقص المناعة ويرتبط ارتباطا وثيقا بالسيتوكينات وعلامات قياس التدفق الخلوي. تتطلب فحوصات الخلايا القاتلة الطبيعية الحالية ملصقات وأدوات ضخمة وأوقات حضانة طويلة.

تملأ منصة LSIT الخاصة بنا هذه الفجوة من خلال تمكين التنميط السريع والميسور التكلفة والخالي من الملصقات باستخدام الإلكترونيات الضوئية البسيطة. تميز منصة LSIT الخالية من الملصقات الخاصة بنا تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية على مستوى خلية واحدة في غضون 30 ثانية باستخدام معلمات الظل ، مما يلغي الحاجة إلى تلطيخ وقياس التدفق الخلوي المكلف. سنقوم بتوسيع LSIT لمراقبة تنشيط الخلايا التائية والبائية ودمج خوارزميات التعلم العميق لتصنيف عالي الإنتاجية لحالات الخلايا المناعية المختلفة.

للبدء ، قم بإزالة مجموعات عزل الخلايا القاتلة الطبيعية ، أو NK ، من الثلاجة واتركها تصل إلى درجة حرارة الغرفة ، بين 15 و 28 درجة مئوية. قم بإعداد المعدات المطلوبة عن طريق وضع فاصل مغناطيسي ، وماصات بأطراف معقمة ، وضبط حاضنة أو كتلة تسخين على 37 درجة مئوية. باستخدام ماصة ، أضف 0.5 مل من الدم الكامل إلى أنبوب التفاعل ذو الغطاء الأخضر الذي يحتوي على كوكتيل الأجسام المضادة.

امزج المحتويات برفق عن طريق سحب الأنبوب لأعلى ولأسفل من خمس إلى ست مرات. ثم احتضن الأنبوب لمدة خمس دقائق. انقل محتويات الأنبوب المغطى باللون الأخضر بالكامل إلى أنبوب الفصل ذو الغطاء الأحمر باستخدام ماصة ، واخلطه برفق عن طريق سحب الأنبوب من خمس إلى ست مرات.

ضع الأنبوب ذو الغطاء الأحمر على الفاصل المغناطيسي واحتضنه في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. مع الحفاظ على المغناطيس في مكانه، استخدم ماصة لنقل ما يقرب من 1.5 مل من المادة الطافية إلى أنبوب الفصل ذو الغطاء الأرجواني الثاني. امزج المحتويات برفق عن طريق سحب الأنبوب من خمس إلى ست مرات.

الآن ، ضع الأنبوب الأرجواني على الفاصل المغناطيسي واحتضنه لمدة 10 دقائق. بينما لا يزال المغناطيس في مكانه ، انقل ما يقرب من 1 مليلتر من المادة الطافية إلى أنبوب استرداد بغطاء رمادي باستخدام ماصة ، واخلط المحتويات بعناية عن طريق سحب الأنبوب. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من تعليق الخلية القاتلة الطبيعية المعزولة إلى أنبوب السيارة و 100 ميكرولتر أخرى في كوكتيل محفز التنشيط ، أو أنبوب ASC.

امزج محتويات كلا الأنبوبين برفق باستخدام خلاط دوامي لضمان التوزيع المتساوي. احتضان الأنابيب في كتلة التسخين أو الحاضنة على 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. قم بتشغيل منصة LSIT.

قم بتشغيل برنامج التقاط LSIT. قم بتسجيل الدخول عن طريق إدخال المعرف وكلمة المرور ، ثم حدد معايرة لبدء وضع المعايرة. اضغط على زر فتح على شاشة اللمس أو استخدم زر الباب المنزلق المادي لفتح الدرج.

عندما يفتح الدرج ، قم بإزالة شريحة المعايرة وتخزينها. الآن ، انقر فوق تعيين الخلفية لمعايرة الشدة البصرية. أعد تركيب شريحة المعايرة في الدرج وأغلق الدرج.

ثم انقر فوق بدء المعايرة لإكمال العملية. قم بإزالة شريحة الفحص من حقيبتها. قم بتسميته ببيانات العينة قبل وضعه على سطح نظيف ومستو.

قم بتعبئة 10 ميكرولتر من عينة السيارة في القناتين A و B ، ثم ماصة 10 ميكرولتر من العينة المحفزة ASC في القناتين C و D. الآن ، اضغط على فتح لإخراج الدرج. قم بإزالة شريحة المعايرة وضعها في صندوق تخزين. أدخل شريحة الفحص المعدة في الدرج واضغط على إغلاق لتثبيتها.

ارجع إلى القائمة الرئيسية وحدد نشاط خلية NK واختباره من الشاشة الرئيسية. أدخل معرف العينة أو امسح الرمز الشريطي ضوئيا لتحميل نموذج ملف التعريف. ثم اضغط على التقاط لبدء تسجيل الصور.

بعد التقاط الصورة ، انقر فوق تحليل لبدء المعالجة. راجع النسبة المئوية لنشاط الخلايا القاتلة الطبيعية وعدد الخلايا المعروضة على الشاشة. قم بتنزيل النتائج على محرك أقراص USB أو اطبعها باستخدام قائمة شاشة اللمس.

حدد عد الخلايا واختبارها على واجهة LSIT الرئيسية. قم بتحميل 10 ميكرولتر من العينة الجديدة على قناة شريحة فحص جديدة باستخدام ماصة. أدخل الشريحة في الدرج.

أغلق الدرج باستخدام شاشة اللمس أو الزر وأدخل معرف العينة على النظام. أدخل عامل التخفيف على شاشة اللمس، إن أمكن، واضغط على العد لبدء القياس الكمي للخلية. عرض النتائج المعروضة كخلايا لكل ميكرولتر على الشاشة.

بعد التحليل ، افتح الدرج بالضغط على زر الفتح أو تبديل المفتاح الفعلي. قم بإزالة الشريحة المستخدمة من الدرج باستخدام الأيدي التي ترتدي القفازات. أخيرا ، ضع شريحة المعايرة مرة أخرى في الدرج لحماية المستشعر وأغلق الدرج باستخدام شاشة اللمس أو مفتاح التبديل الفعلي.

قامت منصة LSIT المزودة ببرنامج متكامل بتقييم تنشيط الخلايا القاتلة الطبيعية كميا من خلال مقارنة قيم CSP لخلايا التحكم المنشطة وغير المحفزة. وزودت تقرير الحصانة بجدول إحصائي موجز. تسبب تحفيز ASC في تغيرات مورفولوجية واضحة في الخلايا القاتلة الطبيعية ، بما في ذلك زيادة الحجم والتعقيد السيتوبلازمي ، كما هو موضح في Cytospins ملطخة بالهيما 3 بعد 30 دقيقة وساعتين.

أظهرت صور الظل أن الخلايا المحفزة بالASC لديها أنماط حيود أكثر تعقيدا بشكل واضح مقارنة بعناصر التحكم في السيارة ، مع المعلمات المستخرجة التي تشير إلى زيادة المسافة من الذروة إلى الذروة ، والحبيبات السيتوبلازمية ، ومعلمة الظل المدمجة. سمحت قيم معلمات الظل المدمجة بتصنيف واضح بين المتبرعين الأصحاء ومرضى السرطان ، مع الحد الأدنى من التداخل في توزيعات الخلية المفردة للخلايا القاتلة الطبيعية المنشطة وغير المنشطة. أظهر المتبرعون الأصحاء قيم مؤشر المناعة الفطرية أعلى بكثير من مرضى السرطان بعد تحفيز ASC.