القياس الكمي لامتصاص الأحماض الدهنية البطانية باستخدام نظائر الأحماض الدهنية الفلورية

يجب أن تعبر العناصر الغذائية المنقولة بالدم، مثل الأحماض الدهنية، حاجز بطانة شعرية لدخول الأنسجة الأيضية عبر آليات غير مفهومة جيدا. قد يكشف توضيح هذه العمليات عن أهداف علاجية جديدة لعلاج أمراض الأيض، مثل السكري من النوع الثاني. وجدنا أن عضلة المشرط والأنسجة الدهنية تنظم امتصاص ونقل الدهون البطانية باستخدام مستقلبات باراكرين، ويتم التحكم جزئيا من قبل الجهاز الصماء أيضا.

كما وجدنا أن ATP الميتوكوندريا يساهم بشكل غير متوقع في امتصاص الدهون في بطانة البطانة رغم اعتماده المعروف على ATP المحلل الجليكولي. باستخدام الاختبار الموضح في هذا البروتوكول، نخطط لاستكشاف الآليات الجزيئية الكامنة وراء امتصاص ونقل الأحماض الدهنية بطانة البطانة، بما في ذلك كيفية تنظيمها بواسطة أنسجة أخرى. للبدء، حضر محلول جيلاتين بنسبة 0.1٪ بإضافة 25 ملليلتر من مرق الجيلاتين 2٪ إلى 475 ملليلتر من PBS.

اخلط محلول الجيلاتين جيدا وقم بتعقمه باستخدام فلتر تفريغ بحجم 0.2 ميكرومتر أو جهاز تعقيم (أوتوكلاف). باستخدام مبابة، أضف 100 ميكرولتر من محلول الجيلاتين بنسبة 0.1٪ في كل بئر من لوح أسود شفاف بقاع 96 بجو. ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة لا تقل عن 30 دقيقة أو طوال الليل.

بعد الحضانة، أزل محلول الجيلاتين الإضافي من الطبق المطلي مسبقا 96 بئر. اغسل الطبق ب PBS مرة واحدة. ثم يتم إدخال 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى كل بئر باستخدام كثافة البذور التي تسمح للخلايا بالوصول إلى الالتقاء بحلول اليوم التالي.

جهز محاليل بحجم 20 ملليمولر من 3-هيدروكسي إيزوبيوتيرات ولاكتات كعوامل تحكم إيجابية. للتحكم السلبي، استخدم نيكلوزاميد ميكرومولر واحد. ثم قم بعمل الماصة على المحاليل في صفيحة منفصلة بسعة 96 بئر.

اغسل خلايا البطانة مرة واحدة باستخدام PBS ثنائي التكافؤ المسخن مسبقا، مع استخدام الماصات بزاوية حادة لتجنب تعطيل الخلايا المغطاة. أضف 50 ميكرولتر لكل بئر من مادة العلاج المناسبة وحضن الطبق على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو 60 دقيقة. لتحضير مركب الأحماض الدهنية BSA، اخلط محلول حمض بوديبي الدهني مكون من 2 ميكرومولر مع 1 حبة دقيقة خالية من الأحماض الدهنية في PBS.

حضن الخليط في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة 10 دقائق قبل الاستخدام. بعد ذلك، أضف 50 ميكرولتر من مركب الأحماض الدهنية BODIPY BSA المحضر إلى كل مركب معالج جيدا وحضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. حضر محلول ميكرومولر واحد من BSA الخالي من الأحماض الدهنية في PBS كحاجز غسيل وسخنه مسبقا إلى 37 درجة مئوية.

أزل مركب الأحماض الدهنية BSA من الآبار واغسل الطبق بالكامل مرتين باستخدام 50 ميكرولتر من محلول الغسيل المسخن مسبقا، مع تنفيذ كل غسيل لمدة 1.5 دقيقة. ثم أضف 50 ميكرولتر من 0.08٪ تريبان بلو إلى كل بئر لتفريغ الفلورة خارج الخلية. باستخدام قارئ الميكروبلايت، قم بقياس التوهج داخل الخلايا فورا.

بعد إزالة محلول التربان الأزرق من الآبار، اغسل الخلايا بلطف باستخدام PBS. أضف 4 ميكروغرامات لكل ملليلتر من صبغة هوشت المخففة في وسط 10٪ إلى كل بئر. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.

ثم اغسل الطبق مرة واحدة ب PBS لإزالة الصبغة الزائدة. بعد ذلك، أضف PBS طازجة إلى كل بئر وقيس فلورة هوشت باستخدام قارئ الألواح الدقيقة. في كل من HUVEC وEA.hy926، ارتفعت إشارة BODIPY-C12 داخل الخلايا بشكل ملحوظ مع ارتفاع تركيزات أحماض BODIPY الدهنية خلال دقيقة وخمس وعشر دقائق من الحضانة.

أدى العلاج باللاكتات لمدة ساعة واحدة إلى زيادة امتصاص BODIPY-C12 بطريقة تعتمد على الجرعة عند تركيزات 5 ميلي مولار و20 مليمول. كما أن العلاج ب 3-هيدروكسي إيزوبيوتيرات حسن بشكل ملحوظ امتصاص BODIPY-C12 بطريقة تعتمد على الجرعة، حيث لوحظ أعلى امتصاص عند 20 ملي مولار. أدى العلاج بنيكلوزاميد ميكرومولر واحد لمدة 30 دقيقة إلى انخفاض كبير في امتصاص BODIPY-C12 مقارنة بالتحكم غير المعالج باستخدام DMSO.

بعد حضانة استمرت خمس دقائق باستخدام BODIPY-C16 في HUVEC، زاد علاج اللاكتات عند 10 ملليمولر و20 ملي مولر بشكل ملحوظ في الامتصاص بطريقة تعتمد على الجرعة. أدى العلاج بنيكلوزاميد ميكرومولر واحد إلى تقليل امتصاص BODIPY-C16 بشكل ملحوظ مقارنة بالتحكم في DMSO غير المعالج.