تحليل R سهل الاستخدام وقوي لمجموعات البيانات واسعة النطاق

نهدف إلى فهم الأساس الجزيئي الذي يقوم عليه كيفية دفاع النباتات ضد مسببات الأمراض، وفي النهاية استخدام هذه المعرفة لتحسين صحة النبات وإنتاجية المحاصيل. يمكن توليد مجموعات بيانات كبيرة بسهولة نسبية في مجال بيولوجي، ومع ذلك، قد يكون تحليل مثل هذه المجموعات الكبيرة في الوقت المناسب تحديا. للبدء، أضف البذور إلى أنبوب طرد مركزي دقيق به ثلاثة فتحات في الأعلى وضع الأنبوب داخل جرة جرس.

ثم يولد بخار المبيض بإضافة ثلاثة ملليترات من حمض الهيدروكلوريك 36٪ إلى 100 ملليلتر من مبيض المنزل في كأس داخل غطاء أبخرة. ضع الكأس في جرة الجرس واتركه في غطاء أبخرة كيميائي لمدة ثلاث ساعات. بعد التعقيم، باستخدام ماصة باستور زجاجية معقمة، يتم وضع البذور على ألواح موراشيغ وسكوغ المتوسطة التي تحتوي على 0.5٪ سكروز و0.8٪ مثقاب داخل خزانة تدفق طبقية.

ضع صفائح موراشيغي وسكوج المطلية والمغلقة في بيئة بدرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة يومين قبل نقلها إلى غرفة زراعة الأنسجة مضبوطة على دورة ضوء 12 ساعة و12 ساعة مظلمة. ثم انقل الشتلات إلى صفيحة تحتوي على 96 بئرا، مع التأكد من أن كل بئر يحتوي على 180 ميكرولتر من وسائط الاختبار. غط اللوحة بطبقة شفافة واحفر فتحتين في كل بئر للتهوية.

ضع الألواح ليوم واحد تحت دورات ضوء 12 ساعة و12 ساعة مظلمة، تليها يوم واحد تحت 24 ساعة من الضوء المستمر. أضف علاجات أو محلول تجريبي لكل بئر. ثم تسجيل قراءات التلميع تحت ظروف إضاءة ثابتة مع ضبط كسب عدسة مرشح الانبعاث على 3,600 وضبط زمن القياس على ثانية واحدة وابدأ جمع البيانات.

في نهاية تسجيل الإضاءة المضيئة، التقط صورة للوحة ال 96 بئر لتوثيق نمو الشتلة. راقب منحنيات البيانات من اختبار التلميض لتأكيد اتساق المعالجة وحفظ بيانات التلميض الخام كملف CSV لتحليل R في المراحل النهائية باستخدام وظيفة الحفظ كوظيفة في برنامج تحليل بيانات قارئ اللوحة. بعد تثبيت برنامج RStudio والحزم الخوارزمية المطلوبة، اختر الدليل العامل الذي يخزن فيه ملف الإدخال، والذي سيكون أيضا مجلد الإخراج للنتائج.

ثم اختر ملف الإدخال CSV المنسق بشكل صحيح. تأكد من أن الصف العلوي يحتوي على نقاط زمنية وأن العمود الأول يسرد مواقع العينات الفردية على لوحة 96 بئرا. قم بتسمية العينات والمعالجات وفقا لترتيب لوحة ال 96 بئرا، لضمان أن التصميم يتضمن إما ثمانية نسخ لكل معالجة مع ما يصل إلى 12 معالجة، أو 12 نسخة مكررة لكل معالجة مع ما يصل إلى ثماني معالجات.

إذا كانت أي صفوف أو أعمدة فارغة، قم بتعيين أسماء مثل Empty1 وEmpty2 وما إلى ذلك إلى قائمة تسميات المعالجة. ثم أشير إلى زمن البداية النسبي لاختبار اللوسيفيراز بناء على وقت بدء الضوء في الحجرة. عدل قسم إدخال المستخدم II ليناسب احتياجات تحليلية محددة.

يشمل توليد الرسوم البيانية لمنحنيات الإضاءة وللمقارنات الزمنية والطورية والسعة عبر الأنماط الجينية والمعالجات. استخدم اختبار ANOVA مع اختبار الفروق الدلالية الصادق من توكي لمقارنة العلاجات بناء على الدورة الشهرية، والطور، والسعة. اختر معالجة ضابطة لمخرجات التحليل أو اترك حقل التحكم فارغا لمقارنة جميع العلاجات بشكل زوجي.

اختياريا، قم بترقيم ملفات مخرجات التحليل لتسهيل المرجعية والتنظيم. الآن، استخدم اختبار t لمقارنة العلاجات بناء على الدورة الشهرية، المرحلة، والسعة. اختر ما إذا كان يجب إجراء اختبار t كمقارنة زوجية، وإذا كان الأمر كذلك، حدد ما إذا كانت البيانات مقترنة.

اختر ما إذا كنت ستعيد نقاط الزمن في مجموعة البيانات. إذا اختلفت قيم الوقت ببضع دقائق فقط، قم بتقربها إلى أقرب ساعة قبل المضي قدما في التحليل. الآن، اضبط تنسيق الإدخال لتحديد الآبار بناء على كيفية تصدير قارئ اللوحات للبيانات.

اختر بين الصيغة القياسية حيث تدرج الآبار بحسب A1 أو A2 أو A3 وهكذا، أو الصيغة البديلة حيث تدرج الآبار بحسب A1 وB1 وC1 وما إلى ذلك. ثم قم بتحليل بيانات اللوسيفيراز بالنقر على زر المصدر الموجود في الزاوية اليمنى العليا من وحدة RStudio. عرض مخرجات التحليل في مجلد المخرجات المخصص، الذي يحتوي على مستندات ومجلدات فرعية تلخص متوسط إحصائيات الفترة والطور والسعة لكل نمط جيني وعلاج.

باستخدام ثقب الخزعة، اقطع أقراص أوراق بقطر أربعة مليمترات من الورقة الرابعة إلى السابعة لنباتات عمرها 25 يوما. قم بتعويم أقراص الأوراق بحيث يكون الجانب المشعر مواجها للأعلى داخل 100 ميكرولتر من الماء المعقم داخل صفيحة مكونة من 96 بئرا. غط لوحة ال 96 بئر بورق معدني نظيف وضعها داخل غرفة نمو فاتحة وداكنة طوال الليل.

ثم أزل اللوحة واستبدل الماء المعقم بمحلول لومينول بسعة 100 ميكرولتر. ابدأ فورا بتسجيل التوهج كل دقيقة لمدة 40 إلى 60 دقيقة. بعد تحميل حزم RStudio المطلوبة، اختر مجلد العمل.

اختر ملف الإدخال، للتأكد من أنه ملف CSV مهيئة بشكل صحيح. يجب أن يحتوي الصف العلوي على بيانات السلاسل الزمنية، ويجب أن يحتوي العمود الأول على مواقع العينة على لوحة مكونة من 96 بئرا. حدد العينات والمعالجات حسب ترتيب اللوحة كما هو موضح سابقا.

صنف الآبار الفارغة صراحة كفارغة1، فارغة2، وهكذا. استخدم اختبار ANOVA مع فرق توكي الصادق ذو الدلالة الدلالة لمقارنة مجموع التلميع الكلي بين العلاجات. استخدم اختبار t ثنائي الوجه عند مقارنة بيانات من علاجين فقط في نفس الوقت.

توليد مخرجات بيانية تشمل منحنيات الفلورة ومخطط شريط يوضح مجموع التلميع الكلي عبر المعالجات. أضف إما الانحراف المعياري أو الخطأ المعياري في المتوسط إلى الأشرطة المرسومة. قم بضبط تنسيق قراءة الإدخال بناء على كيفية إخراج قارئ اللوحة للمعرفات الجيدة.

اختر بين القائمة القياسية ب A1 أو A2 أو A3 أو القائمة الرأسية بواسطة A1 أو B1 C1.To إجراء التحليل، اضغط على زر المصدر الموجود في الزاوية اليمنى العليا من وحدة تحكم RStudio. عرض المخرجات في المجلد المولد، الذي يحتوي على عدة مستندات ومجلدات فرعية تلخص التحليل الكامل. تم إجراء اختبار اللوسيفيراز باستخدام خط معدلة وراثيا يعبر عن مراسل لوسيفيراز CCA1 وسبعة خطوط معدلة وراثيا مستقلة تعبر عن مراسل لوسيفيراز GRP7.

تم قياس آثار التوهج لهذه النباتات على مدى 168 ساعة. باستخدام طريقة R، تم الحصول على معاملات الساعة المحسوبة لمبلغ لوسيفيراز CCA1 بسعة 3,000 وحدة توهج نسبي في الثانية لكل شتلة، وفترة 23.5 ساعة، وطور 3.5 ساعة. جميع خطوط لوسيفيراز pGRP7 أظهرت قيم فترة وطور متشابهة، لكنها اختلفت في السعة.

مدة pGRP7 لوسيفيراز هي 24.2 ساعة، بينما المرحلة 12 ساعة. لتأكيد تحليل R بشكل أكبر، تم إعادة تحليل نفس مجموعة البيانات باستخدام BioDare2، وهي منصة مجانية على الإنترنت لتحليل البيانات اليومية 8، وتم الحصول على نتائج مماثلة. تم إعادة تحليل البيانات اليومية التي تم توليدها باستخدام خلايا U2 OS التي تعبر عن مراسل Per2dLuc باستخدام طريقة R.

أظهرت مجموعة الضابطة سعة تبلغ 184.8 وحدة إضاءة نسبية، وفترة 23.3 ساعة، وطور 2.8 ساعة. أدى انخفاض CRY2، وليس PSMD4 وPSMD7، إلى تأثير كبير على معايير الساعة البيولوجية، والسعة، والطور، والفترة. كانت هذه النتائج متوافقة مع النتائج المنشورة.

كشفت أبحاثنا أن الساعة البيولوجية مهمة للدفاع المخطط ضد مسببات الأمراض. لقد استخدمنا البروتوكول الموضح هنا بشكل روتيني لتحليل مجموعات بيانات السلاسل الزمنية واسعة النطاق من كل من اختبارات الساعة والدفاع. بروتوكولنا باستخدام سكريبتات R في RStudio يوفر أداة سهلة الاستخدام ومريحة للباحثين الذين يعملون مع بيانات السلاسل الزمنية واسعة النطاق.

بروتوكولنا، سهل الاستخدام، يحتوي على عدة خيارات إحصائية، ويسمح للمبتدئين الذين لا يمتلكون معرفة سابقة أو خبرة برمجية في R باستخدامه.