تقييم تأثير عوامل SASP على تكاثر الخلايا السرطانية باستخدام تحليل مقارن لثلاث منهجيات متميزة

تفرز خلايا السرطان المسننة مثل هذه العوامل التي تؤثر على الخلايا المجاورة. نقدم ثلاثة نماذج مختبرية لدراسة تأثيرات الباراكرين والجوارث المدفوعة ب SASP على تكاثر خلايا HeLa، ورصد المعاوقة في الوقت الحقيقي وتصوير الخلايا الحية مكنها من التحليل الديناميكي والحركي والشكلي الذي يكشف عن تأثيرات باراكرين في الشيخوخة والبيئة الدقيقة تتجاوز اختبارات النهاية التقليدية. للبدء، شغل نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي قبل زرع الخلية.

شغل برنامج RTCA الإصدار 2.0. انقر على زر X وإدخال تفاصيل التجريب. انقر على زر الجدولة وأضف خطوتين لتسجيل الخلفية ومراقبة انتشار الخلايا كل 15 دقيقة لمدة 72 ساعة.

اختر الخطوة الأولى واضغط على زر التشغيل. أضف يدويا 50 ميكرولتر من الوسط الكامل إلى كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية. بعد ذلك، اغسل كل من خلايا هيلا المسننة وغير المتقدمة بالشيخوخة بخمسة ملليلتر من PBS المعقمة والمسخنة مسبقا.

بعد الشفط، أضف ملليتر واحد من التريبسين الدافئ مسبقا 0.05٪ وبدأ الحضانة. قم بتحييد التربسين بخمسة ملليلتر من DMEM الكامل المكملة بالمضادات الحيوية. ثم قم بعمل الطرد المركزي على الخلايا على حرارة 500 جرام في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق.

بعد التخلص من الفائق، أعد تعليق حبيبات الخلايا في خمسة ملليلتر من DMEM الكامل المدعوم بالمضادات الحيوية. الآن، زرع خلايا HeLa غير المتسللة في كل بئر من عرض صفيحة إلكترونية واحدة في 100 ميكرولتر من DMEM الكامل المدعم بالمضادات الحيوية. ضع عرض اللوحة الإلكترونية في مهد نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي للسماح للخلايا بالالتصاق بسطح اللوحة في الحاضنة.

اختر الخطوة الثانية واضغط على تشغيل لبدء قياس الممانعة. خلايا البذور في اللوحة الإلكترونية تحتوي على 60 ميكرولتر من DMEM الكامل المكملة بالمضادات الحيوية ضمن ثلاث إعدادات تجريبية مختلفة. حافظ على إدخال اللوح الإلكتروني عند 37 درجة مئوية في الحاضنة مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ست ساعات للتركيب.

اضغط على إيقاف مؤقت بعد ست ساعات من بذر الخلايا، ثم استنشق وسط الزراعة بلطف من كل بئر في عرض الصفيحة الإلكترونية لإزالة المصل والخلايا غير الالتصقة. غسل الآبار مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا عند 37 درجة مئوية. أضف 140 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل إلى كل بئر في عرض اللوحة الإلكترونية.

أزل الوسيط. اغسل آبار اللوحة الإلكترونية باستخدام PBS، ثم أضف 60 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل. الآن، ضع لوحة ال الإلكترونية في عرض اللوحة الإلكترونية.

اضغط بلطف حتى يتم زرع الإدخال بالكامل في البئر. أدخل اللوحة المركبة في نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي. انقر على تشغيل لاستئناف المراقبة الفورية لقيم مؤشر الخلايا بفواصل زمنية مدتها 15 دقيقة باستخدام البرنامج.

تطبيع قيم مؤشر الخلية في النقطة الزمنية التي يتم فيها دمج عرض اللوحة الإلكترونية وإدخال اللوحة الإلكترونية وإدخالها في نظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي. بعد ذلك، اضغط على زر تحليل البيانات لحساب معدل التكاثر والكمية باستخدام أقصى مؤشر خلوي وبيانات ميل تم الحصول عليها من نظام تحليل الخلية في الوقت الحقيقي. ثم حلل البيانات باستخدام برنامج إحصائي مناسب.

استنشق وسط الزراعة من كل من الصفائح ذات الستة آبار التي تحتوي على خلايا HeLa المتقدمة وغير المسنة. اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لإزالة بقايا المصل والحطام الخلوي. أضف ملليلتر من وسط DMEM الخالي من المصل والمكملة بالمضادات الحيوية إلى كل بئر، ثم حضن الخلايا في حاضنة رطبة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة.

اجمع الوسائط المكيفة من كل بئر في أنابيب معقمة داخل خزانة أمان طبقية. قام بالطرد المركزي بجمع الوسائط المكيفة عند 1000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية لإزالة حطام الخلية، ثم الطرد المركزي عند 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية للحصول على المادة الفائقة الموضحة. ثم يتم الطرد المركزي على الوسط المكيف باستخدام وحدات مرشح مركزية فائقة الطرد المركزي بسعة ملليتر عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 60 دقيقة عند 3000 جرام لتركيزه إلى 400 ميكرولتر.

قم بتخفيف المركز الناتج بوسط جديد خال من المصل لتحضير وسائط مركزة معدلة 1x و2x و3x في أنابيب معقمة في كابينة أمان سطحية. عندما تلتصق الخلايا، استنشق وسط الزراعة بلطف من كل بئر من منظور الصفيحة الإلكترونية لإزالة المصل والخلايا غير الملتصقة واغسله باستخدام PBS. بعد ذلك، تم تسخين الوسائط المجمعة بحجم 200 ميكرولتر من الماصة مسبقا عند 37 درجة مئوية في كل مجموعة.

أدخل عرض اللوحة الإلكترونية في نظام تحليل الخلايا في الوقت الحقيقي واضغط على تشغيل لاستئناف المراقبة الفورية لقيم مؤشر الخلايا بفواصل زمنية 15 دقيقة لمدة 48 ساعة. تزرع الخلايا على شريحة دقيقة تحت ثلاث إعدادات تجريبية وتحتضن عند 37 درجة مئوية في جو رطب يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ثماني ساعات من التثبيت، اغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS المسخن مسبقا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

أضف 200 ميكرولتر من Dulbecco Modified Eagle's Medium الخالي من المصل إلى كل بئر. شغل وحدة تحكم الحرارة 2002-2 واضبطها على 37 درجة مئوية. شغل وحدة تحكم ثاني أكسيد الكربون 2000 واضبطه على 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

شغل مصدر ضوء الفلورة. ضع الشريحة على غرفة الحضانة في أعلى المسرح. شغل البرنامج على الكمبيوتر.

اختر هدف 20x. أضف قناة التباين الطور وقناة FITC الفلورية. باستخدام وحدة تحكم المسرح، حدد المواقع لكل موقع.

اضبط الفترة الزمنية إلى 30 دقيقة ومدة الشراء إلى 48 ساعة، ثم ابدأ عملية الاستحواذ. عد الخلايا الإيجابية للبروتين الفلوري الأخضر في كلا النقطتين الزمنيتية وحساب نسبة الزيادة للتحليل. أدى علاج دوكسوروبيسين إلى تحفيز كبير في شيخوخة الخلايا في خلايا هيلا.

أظهر قياس الخلايا الإيجابية لحمض الثوريليين-بيتا-جال نسبة أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة الدوكسوروبيسين مقارنة بالمجموعة الضابطة. في النهج الأول، أظهرت خلايا HeLa غير الشيخوخة التي تم زراعتها معا مع خلايا HeLa الشيخوخة معدل تكاثر وقدرة أعلى بشكل ملحوظ مقارنة بالخلايا التي تم زراعتها مع خلايا HeLa غير المسنة. الأوساط المكيفة المستخرجة من خلايا HeLa المتقدمة في السن بتركيزات 2x و3x زادت بشكل ملحوظ من معدل وسعة خلايا HeLa غير المتقدمة للشيخوخة مقارنة بالوسائط المكيفة من الخلايا غير المتقدمة بالشيخوخة.

في النهج الثالث، بعد 48 ساعة من الزراعة المشتركة، أظهرت خلايا HeLa الإيجابية ل GFP زيادة أكبر بشكل ملحوظ في التكاثر عند زراعتها المشتركة مع خلايا HeLa المتقدمة في السن مقارنة بخلايا الصيد المشتركة غير المسنة أو التي تعتمد فقط على GFP.