الكشف عن التحكم الكهروميكانيكي في توازن الأنسجة باستخدام جهاز الموائع الدقيقة من طبقتين

نطبق المجالات الكهربائية الخاضعة للرقابة لدراسة كيفية استجابة الأنسجة للإشارات الكهربائية ، مع التركيز على كيفية تنظيم التيارات أو الحقول للتصاق الخلايا وتكاثرها وبثقها ، مما يؤثر على توازن الأنسجة. اكتشفنا أن اتجاه التيارات ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية يملي حالات الأنسجة. أدى المجال القمي إلى الحقل القاعدي إلى النمط الظاهري التكاثري ، بينما يعزز المجال القاعدي إلى القمي بثق الخلية ، مما يسمح بتعديل كثافة الخلية الإجمالية.

في حين أن الدراسات الكهروحرية الحيوية الكمية قد ركزت منذ فترة طويلة على الهجرة عن طريق انجذاب الجاذبية ، إلا أن توازن الأنسجة لا يزال يتعذر الوصول إليه. يتيح نظامنا الآن التحقيق المباشر لكيفية تنظيم الكرتون الفسيولوجي لتنظيم الأنسجة وصيانتها. يدمج بروتوكولنا الموائع الدقيقة ، والتحفيز الكهربائي للأنسجة ، والفحص المجهري للهيكل والقوة ، والتصوير الحي لدراسة التحكم الكهروميكانيكي في توازن الأنسجة.

كشف عملنا عن قواعد التوصيل الكهروميكانيكية الأساسية. باستخدام أدوات جديدة ، يمكننا الآن استكشاف كيفية ظهور الأنماط الكهروحرية الحيوية الأصلية وتنظيم الأنسجة وما إذا كان بإمكاننا التحكم في سلوك الأنسجة المعقدة عن طريق ضبط هذه الإشارات الكهروميكانيكية. للبدء ، ضع طبقة نظيفة واحدة من قالب polydimethylsiloxane ، أو PDMS ، ووجهها لأعلى على غطاء طبق بلاستيكي نظيف وأضف 500 ميكرولتر من المادة اللاصقة السائلة القابلة للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية ببطء على القالب.

باستخدام ملعقة ، بلل بعناية جميع الهياكل البارزة وقم بإزالة أي فقاعات هواء تشكلت أثناء عملية الترطيب. اضغط برفق على زلة الغطاء على قالب PDMS واستخدم ممسحة مختبر لإزالة أي مادة لاصقة زائدة قابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية ، مما يضمن بقاء الجانب العلوي من انزلاق الغطاء نظيفا ومسطحا. عالج الهيكل جزئيا تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية المضاء بشكل موحد بطول موجي يتراوح بين 363 و 370 نانومتر.

امسح أي علامات باستخدام 75٪ إيثانول. بعد ذلك ، أمسك الهيكل بإحكام على سطح مستو وقشر قالب PDMS ببطء من الطبقة الأولى المعالجة. بعد ذلك ، ضع طبقة نظيفة من قالب PDMS مقلوها لأسفل على لوح PDMS مسطح يزيد سمكه عن 2.5 ملم.

اضغط برفق على ميزات القالب من الأعلى باستخدام الملقط. راقب الواجهة الموجودة أسفل ميزات التغميق أو التباين البصري ، مما يؤكد الاتصال المناسب. الآن ، املأ الفراغ بين قالب PDMS والبلاطة بمادة لاصقة سائلة قابلة للعلاج بالأشعة فوق البنفسجية عن طريق العمل الشعري.

عالج الهيكل جزئيا تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 ثوان ، كما هو موضح سابقا. استخدم ملاقط مبطنة ناعمة لتقشير الطبقة اللاصقة المركبة القابلة للمعالجة بالأشعة فوق البنفسجية وقالب PDMS برفق من لوح PDMS. إذا لزم الأمر ، قم بقص الحواف الزائدة للطبقة اللاصقة المعالجة بمقص حاد.

بعد ذلك ، ضع الطبقة الأولى المرفقة بغطاء زجاجي مستطيل على سطح مستو. قم بمحاذاة الطبقة الثانية ، التي لا تزال متصلة بقالب PDMS الخاص بها ، مع الطبقة الأولى واضغط على كلتا الطبقتين معا بقوة حتى تظهر الظلال أسفل الملامح. عالج الهيكل المحاذاة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة 10 ثوان لربط الطبقتين الأولى والثانية في شريحة موائع دقيقة من طبقتين ، ثم قشر قالب PDMS برفق من الرقاقة المستعبدة.

ضع على الفور ماصة 10 ميكرولتر من محلول سلائف هلام بولي أكريلاميد في منتصف منطقة الأنسجة مباشرة فوق الشق في الطبقة الثانية. اضغط برفق على غطاء زجاجي دائري ، قطره 10 ملم ، على القطرة لتشكيل جل مسطح. راقب تدفق محلول الجل إلى الطبقة الأولى من خلال الشق وتوقف عند صف أعمدة الحاجز.

عالج على الفور رقاقة الموائع الدقيقة المجمعة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، اترك الرقاقة دون إزعاج لمدة ساعة تقريبا للسماح لهلام بولي أكريلاميد بالتصلب الكامل. بعد ذلك ، احتضن رقاقة الموائع الدقيقة في مخزن مؤقت HEPES 0.1 مولار عند درجة حموضة 7.4 لمدة ساعة واحدة على الأقل لترطيب الجل وتقليل الالتصاق بين الجل وانزلاق الغطاء.

بعد ذلك ، استخدم ملاقط حادة برفق لإزالة انزلاق الغطاء من سطح الجل. ضع خرطوشة بولي كربونات طبية على سطح مستو بحيث يكون وجهها السفلي لأعلى وقم بمحاذاة شريحة مجففة ووجهها لأسفل مع الخرطوشة. ماصة لاصقة قابلة للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية في الشقوق بين الرقاقة والخرطوشة ، وتعبئتها عن طريق التأثير الشعري ، ومعالجتها تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية.

قم بتعقيم أجهزة الموائع الدقيقة المصنعة عن طريق وضعها تحت الأشعة فوق البنفسجية عند 200 إلى 280 نانومتر داخل خزانة السلامة البيولوجية. تحضير الحجم المطلوب من 50 ميكروغرام لكل مليلتر الكولاجين واحد محلول عمل في 1X DPBS على الثلج. على الجليد ، قم بإعداد محلول العمل Sulfo-SANPAH عن طريق تخفيف اثنين من ميكرولتر من محلول مخزون Sulfo-SANPAH ، المذاب مسبقا في ثنائي ميثيل سلفوكسيد اللامائي في 80 ميكرولتر من المخزن البارد HEPES 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.4 المخزنة عند أربع درجات مئوية.

ربت على حواف جل بولي أكريلاميد بمناديل معملية لتجفيفه داخل الجهاز. قم بماصة 80 ميكرولتر من محلول العمل Sulfo-SANPAH على سطح الجل ، مما يضمن الانغماس الكامل ، ووضع الرقاقة تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق لتنشيط Sulfo-SANPAH. اشطف الجل ثلاث مرات بمحلول HEPES بارد 0.1 مولار عند درجة الحموضة 7.4.

كرر معالجة Sulfo-SANPAH عن طريق سحب 80 ميكرولتر من محلول العمل SS فوق الجل وتشعيعه تحت الأشعة فوق البنفسجية لمدة خمس دقائق. هذه المرة ، اشطف الجل ثلاث مرات باستخدام 1X DPBS البارد. أخيرا ، قم بتعبئة 100 ميكرولتر من محلول الكولاجين على هلام بولي أكريلاميد ، مما يضمن تغطية كاملة ، واتركه لمدة ساعة واحدة.

اشطف الكولاجين غير الملتصق ب 1X DPBS ثلاث مرات ، ثم احتفظ بالجل مغمورا في 1X DPBS حتى الاستخدام مرة أخرى. قم بتوصيل الأجهزة بالإدخالات باستخدام البراغي. بعد ذلك ، قم بتأمين ما يصل إلى أربع مجموعات إدخال للجهاز في الحامل المصمم للتركيب على مرحلة المجهر.

أضف ملليلتر من وسط الاستزراع إلى كل بئر رئيسي للأجهزة ومن خلال قنوات إزالة النفايات لطرد واستبدال 1X DPBS. بعد ذلك ، أدخل أقطاب البلاتين في الأنبوب الذي يحتوي على 45 مل من الوسط ، وتأكد من غمرها بالكامل في الوسط. اسحب وسط الاستزراع من خلال أنبوب Tygon بحقنة وقم بتثبيته بإحكام.

قم بتوصيل أحد طرفي الأنبوب متوسط التعبئة بغرفة القطب الكهربائي والطرف الآخر بالجهاز. الآن ، قم بإعداد معلق الخلية باتباع توصيات تحضير التربسين أو تعليق الخلية وزرع 0.1 مليون خلية في البئر الرئيسي. قم بتركيب الإعداد على المجهر باستخدام غرف القطب الكهربائي على الجانبين وقم بتوصيل مقياس المصدر بغرفة القطب.

استخدم ثلاثة أجهزة ذات مقاومة قناة متطابقة. قم بتعيين واحد كمجموعة تحكم. قم بتطبيق التيار القمي على التيار القاعدي على الجهاز الثاني والتيار القاعدي إلى القمي على الجهاز الثالث.

مصدر إشارة كهربائية في ظل وضع المشبك الحالي وتوفير تيار إجمالي يبلغ 20 ميكروأمبير. اختر عدسة موضوعية 20X لتصوير الأنسجة الكاملة باستخدام مجهر مضان. أخيرا ، اختر القناة 561 لقنوات التألق الأحمر وقنوات المجال الساطع.

حدد فاصلا زمنيا مدته ساعة واحدة أثناء التصوير لفترة طويلة. تم تطبيق التحفيز الكهربائي بشكل عمودي على الخلايا لتعطيل الإمكانات عبر الظهارة لدراسة دورها في سلوك الأنسجة في ظل اتجاهات تيار مختلفة. تحت تصوير تباين الطور ، تسببت التيارات القمية إلى القاعدية أو ATB في سطوع تقاطعات الخلايا في غضون 10 دقائق من التطبيق ، بينما أظهرت ظروف التحكم والقاعدية إلى القمية ، BTA ، تباينا منخفضا وأسطحا قمية مسطحة.

أنتجت تيارات ATB تحدبا خارجيا عند سطح الخلية القمية. كان تشوه الهلام يعتمد بشدة على اتجاه التيار. سحبت تيارات ATB الجل لأعلى ، بينما ضغطت تيارات BTA الجل لأسفل.

زادت شدة E-cadherin الوصلية تحت تيارات BTA ، لكنها انخفضت بشكل ملحوظ تحت تيارات ATB مقارنة بالتحكم. انخفضت شدة الأكتين الوصلي تحت تيارات ATB ، لكنها لم تزد بشكل كبير تحت تيارات BTA بالنسبة للتحكم. أدت تيارات ATB إلى بثق الخلايا الحية متعددة الخلايا عبر الطبقة الأحادية ، بينما حافظت تيارات BTA على بنية أحادية الطبقة ، على غرار التحكم.

كان عدم التجانس المكاني في توزيع الخلايا أعلى بشكل ملحوظ في ظل تيارات ATB ، لكنه ظل منخفضا وموحدا في ظل BTA وظروف التحكم. زادت معدلات تكاثر الخلايا تحت تحفيز ATB ، مع معدلات انقسام أعلى بمرور الوقت. في المقابل ، تسببت تيارات BTA في المزيد من أحداث موت الخلايا.