تشريح الأنسجة القحفية الوجهية لسمك الزرد عند تلطيخها باللون الأزرق ألسي

نحن نستكشف الآليات التي ينمو بها حنك أسماك الحمار الوحشي بمرور الوقت باستخدام عينات ثابتة بالإضافة إلى تصوير الفاصل الزمني للأجنة ذات الدقة الزمنية المكانية العالية باستخدام الفحص المجهري للصفائح الضوئية. بروتوكولنا بسيط وسهل المتابعة. يضع خطوات مفصلة لتشريح وفصل الغضاريف القحفية الوجهية ليرقة سمك الزرد البالغة من العمر خمسة أيام.

مكن هذا البروتوكول من التوصيف الدقيق لشكل الحنك في الأنسجة والمقاييس الخلوية ، مما سمح لنا في النهاية بتقييم تأثير مستضدات التعليق على تشكل الحنك. للبدء ، احصل على 20 إلى 25 يرقة أسماك حمار وحشي مخدرة ، وقم بإزالة المخدر بمجرد توقف اليرقات عن الحركة. أضف 1.5 مل من ألدهيد 4٪ paraform إلى الأنبوب ، وضع العينة على آلة هزاز مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من المثبت من الأنبوب. ثم أضف 1.5 مل من 50٪ إيثانول إلى العينة ، وضعها على هزاز في درجة حرارة الغرفة مضبوطة على 60 دورة في الدقيقة لمدة 10 دقائق. الآن باستخدام ماصة ، استنشق الإيثانول من الأنبوب ، وأضف 1.5 مل من محلول البقع الأزرق السياني إلى العينة.

احتضن اليرقات في محلول البقع لمدة 18 إلى 20 ساعة في درجة حرارة الغرفة أثناء التأرجح بمعدل 60 دورة في الدقيقة. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول البقع باستخدام ماصة ، واغسل اليرقات ب 1.5 مل من الماء المقطر لمدة دقيقة إلى دقيقتين على هزاز في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف مليلترا واحدا من محلول التبييض إلى العينة ، واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة دون تغطية الأنابيب.

باستخدام ماصة ، قم بإزالة محلول التبييض من العينة ، وعالج العينة بمحاليل إزالة الأنسجة واحد واثنين. بعد إزالة المحلول الثاني ، أضف 1.5 إلى ملليلتر من محلول التخزين إلى العينة. نظرا لمحتوى الجلسرين ، لاحظ أن العينات الملطخة تغرق تدريجيا في القاع في غضون 10 دقائق.

ضع يرقة ملطخة على جانبها الجانبي في طبق بتري مغطى بالاغاروز. باستخدام الملقط ، اكشط صفار البيض برفق من جسم اليرقات. بعد إزالة صفار البيض ، انقل اليرقات إلى طبق بتري جديد لتجنب التداخل أثناء التشريح ، وأمسك اليرقات بالقرب من الجزء الخلفي من الرأس باستخدام زوج واحد من الملقط.

مع زوج آخر ، قم بإزالة العينين بعناية دون الإضرار بهياكل الوجه القحفية المحيطة. أثناء الإمساك باليرقة ، لا يزال مع زوج واحد من الملقط ، قم بعمل شق في وسط الأنسجة الظهرية إلى الجمجمة العصبية. ثم قرصة وسحب الدماغ والأنسجة المرتبطة به.

بعد ذلك ، افصل رأس اليرقات عن بقية الجسم. يجب أن تشمل منطقة الرأس الناتجة الجمجمة العصبية ، والجمجمة الحشوية التي لا تزال متصلة في الأطراف الأمامية والخلفية. اقطع بعناية نقطتي التوصيل بين الجمجمة العصبية والجمجمة الحشوية بملقط لفصلهما تماما.

أخيرا ، ضع قطرة أو قطرتين من الجلسرين بنسبة 100٪ على شريحة زجاجية نظيفة ، وانقل الجمجمة العصبية المشرحة أو الجمجمة الحشوية إلى الشريحة. باستخدام الملقط ، ضع غطاء برفق فوق المناديل الورقية لضمان عدم احتجاز فقاعات الهواء ، وأغلق انزلاق الغطاء بطلاء الأظافر قبل التصوير. عرضت الجمجمة العصبية المشرحة العديد من الهياكل المسماة بوضوح ، بما في ذلك الصفيحة الغربالية ، والتربيق ، والغضاريف التامورية ، مما يتيح التحليل الهيكلي التفصيلي.

تضمنت الجمجمة الحشوية غضروف ميكل ، وعناصر إضافية مثل رباعي البالاتو ، والغضاريف الريحانية. أتاح التلوين الأزرق Alcian بعد خمسة أيام من الإخصاب تصورا واضحا للصفيحة الغربالية. كان عرض وطول الصفيحة الغربالية قابلين للقياس باستمرار باستخدام تحليل الصور ، وكان الطول أكبر بكثير من العرض ، والبيانات الكمية من 15 عينة.

تم استخراج منطقة الصفيحة الغربالية من بيانات الصورة ، وتم تأكيدها من خلال القياس الكمي بعلامات حدود واضحة. لوحظت ترتيبات خلوية مميزة في الصفيحة الغربالية مع خلايا مكعبة في المنطقة الإنسية ، وخلايا كولومر في الأجزاء الجانبية. سمح تلطيخ Dappy بتصور نوى الخلايا الفردية داخل الصفيحة الغربالية.