تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي لخلية عصبية الدائرة الشمية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء الطورية الثالثة

يستخدم هذا البروتوكول مادة لاصقة للأنسجة GLUture لتعزيز القدرة في تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي. يسمح هذا للباحثين بفهم ديناميكيات الكالسيوم في الخلايا العصبية للدائرة الشمية في يرقات ذبابة الفاكهة ذات الطور الثالث. البساطة وكفاءة التكلفة هما الميزتان الرئيسيتان لهذه التقنية ، مما يجعل التجارب أكثر موثوقية ويمكن الوصول إليها في البحوث الفيزيولوجية العصبية.

قم بإعداد غرفتي تغذية عن طريق وضع مربع صغير من المناديل الكيميائية في أطباق بتري بتري بطول ستة سنتيمترات. لظروف الجوع ، أضف 350 ميكرولتر من الماء المقطر. للظروف غير الجائعة ، أضف 350 ميكرولتر من محلول السكروز 0.2 مولار.

انقل عددا متساويا من اليرقات المغسولة إلى كل غرفة تغذية. اسمح لليرقات بالتغذي على السكروز أو الماء غير الجائع أو المقطر ، الجائع ، لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة على زجاج غطاء مجهر بسمك 24 × 50 ملم ، بسمك 1.5 ملم ، قم بإنشاء بئر باستخدام الفازلين الموزع من حقنة. ضع قطرة صغيرة من لاصق الأنسجة الموضعية في وسط زجاج الغطاء.

انشر الغلفة بالتساوي في طبقة رقيقة وموحدة باستخدام قضيب زجاجي. انقل يرقة واحدة بعناية إلى الجليكة باستخدام فرشاة أو سلك رفيع. اضغط برفق على الجانب البطني من اليرقات على المادة اللاصقة.

اترك الجلوس حتى يجف ، مع التأكد من أن اليرقات مشدودة تماما. بمجرد تثبيت اليرقات ، اغمر اليرقة في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتصوير. ضع زجاج الغطاء على مجهر مقلوب Leica DMi8 ، متصل بوحدة ماسح ضوئي متحد البؤر لقرص الغزل Yokogawa CSU-W1 ، وكاميرا CCD لتصوير الكالسيوم.

قم بإعداد غطاء زجاجي مجهر مع GLUture لتصوير الكالسيوم ، كما هو موضح في الخطوات 3.2 إلى 3.3. أكمل التشريح كما هو موضح من قبل إيشيموتو وسانو ، 2018. باستخدام ماصة صغيرة P-10 ، قم بشفط الدماغ التشريح بعناية بخمسة ميكرولتر من محلول التشريح من طبق بتري.

طرد الدماغ ببطء على GLUture. قبل أن يجف GLUture ، قم بتوجيه الدماغ في وضع الجانب الظهري لأعلى بحيث يكون فصي الدماغ متجهين لأسفل والحبل البطني الظهري متجها لأعلى. باستخدام ماصة صغيرة P-200 ، انقل 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتصوير الكالسيوم فوق دماغ اليرقات المجمدة على زجاج الغطاء.

افتح VisiView لتصوير الكالسيوم باستخدام مجهر الغزل المقلوب Leica DMi8. التقط الصور باستخدام 10X / 1.4 أي هدف باستخدام المرشحات ، والتبديل بين ليزر GFP وليزر RFP. تتراوح قيم التعريض الضوئي من 100 إلى 1000 مللي ثانية ويتم ضبط الكسب على 50٪ من قيمة التعريض الضوئي المقابلة.

يتم تطبيق عامل عروض الأسعار اثنين أثناء التقاط الصور. حدد الخلايا العصبية ذات الأهمية من خلال البحث عن إشارة tdTomato باستخدام ليزر RFP. بمجرد تحديد منطقة الاهتمام ، قم بالتبديل إلى ليزر GFP لالتقاط إشارات GCaMP6f.

تأكد من عامية كل من إشارات tdTomato و GCaMP قبل التقاط صور المكدس لكلتا القناتين. التقط تسجيلين منفصلين من السلسلة الزمنية لإشارات نجاح tdTomato و GCaMP6f في وقت واحد بمعدل 0.5 إطار في الثانية ، لمدة أسبوع إجمالي. قم باستيراد مكدسات إشارات tdTomato و GCaMP6f إلى ImageJ.

لتحديد منطقة الاهتمام الصحيحة، ادمج إشارات tdTomato وGCaMP6f لتأكيد التحديد المشترك. بعد التحقق ، قم بتقسيم قناتي tdTomato و GCaMP6f. قم باستيراد وحدات الماكرو المخصصة المستندة إلى عائد الاستثمار إلى ImageJ.

حدد مكدس GCaMP6f واضغط على تشغيل لتحليل الكالسيوم. يقوم الماكرو أولا بإنشاء إسقاطات قصوى للشدة ، ويقوم بتصحيح الحركة ، باستخدام المكون الإضافي Stack reg ، ويطبق تصحيح التبييض. تم إجراء تصحيح الحركة عن طريق تحديد منطقة مستطيلة واسعة ذات أهمية ، مثل فص الدماغ في كل إطار.

يجب أن يغطي الصندوق المستطيل عائد الاستثمار بالكامل في جميع الإطارات لضمان تصحيح دقيق للحركة ، مع الاحتفاظ بالشكل المحلي والمكاني وعائد الاستثمار عبر جميع الإطارات. كل عائد استثمار ، وحدات الماكرو المحسوبة واحدة ، الكثافة عبر جميع الإطارات ، اثنان ، فرق التذبذب الأساسي ، مثل الفرق بين قيم الكثافة القصوى والدنيا خلال أول 10 إطارات ، وثلاثة ، الحد الأقصى لتغير شدة الإطار إلى الإطار ، تم التخلص من Delta F.ROIs التي تظهر تقلبات الشدة أقل من 10 وحدات. تم تنظيم مجموعة البيانات النهائية في أربعة أعمدة ، واحد ، الوقت والأطر ، واثنان ، وظروف العينة التي تم تجويعها أو تغذيتها ، وثلاثة معرفات طبق الأصل ، وعينات فردية ، وأربعة ، كثافة طبيعية.

F قيمة معيارية تم تحجيمها من صفر إلى واحد. أخيرا ، تم إجراء تحليل البيانات وتصورها في R ، باستخدام نصوص R المخصصة. تم تثبيت الحزم المطلوبة ، بما في ذلك ggplot2 و dplyr و readr وتحديثها قبل تشغيل التحليل.

تضمن الإخراج خرائط حرارية توضح شدة الكالسيوم الطبيعية لأول 30 إطارا ، و 60 إطارا ، وجميع الإطارات في تسجيل السلاسل الزمنية ، ومخططات مربعة لإظهار متوسط الشدة الطبيعية. تم تقييم أهمية شدة الكالسيوم الطبيعية باستخدام اختبار Mann-Whitney U. الشكل الأول هو تخطيطي لإعدادات تصوير الكالسيوم في الجسم الحي وخارج الجسم الحي.

تم تثبيت عينة اليرقات الكاملة أ ، أو عينة دماغ اليرقات ب ، على طبقة رقيقة من GLUture باللون الأزرق الصلب ، منتشرة داخل بئر من الفازلين ، ومستديرة على زجاج غطاء مجهر. تم غمر العينات في المخزن المؤقت لتصوير الكالسيوم ، باللون الأزرق الفاتح ، ووضعها للتصوير على مجهر متحد البؤر مقلوب على قرص دوار. تم التقاط سلسلة زمنية من صور مضان الكالسيوم للعينات.

تم إعداد التخطيطي باستخدام BioRender. يوضح الشكل الثاني التصوير الفلوري GCaMP6f. أ ، صور مقسمة تظهر التألق في قناة 488 نانومتر ، GCaMP6f والأخضر ، وقناة 525 نانومتر ، tdTomato باللون الأحمر.

تظهر الصورة المدمجة في اللوحة اليمنى. ب ، مثال على آثار التألق الخام بمرور الوقت ل GCaMP6f باللون الأخضر و tdTomato باللون الأحمر في LNs الأساسية. يشير التذبذب في مضان GCaMP6f إلى نشاط الكالسيوم بينما يتم استخدام إشارة tdTomato المستقرة كعنصر تحكم لتحديد LNs الأساسية.

C ، صور إشارة GCaMP6f التمثيلية لللوحات العلوية في الجسم الحي واستعدادات اللوحة السفلية خارج الجسم الحي. تظهر العينات غير الجائعة على اليسار ، وتظهر العينات الجائعة على اليمين. يصور الشكل الثالث قياسات التألق GCaMP6f.

أ ، تظهر اللوحة العلوية اليسرى خريطة حرارية تعرض متوسط الديناميكيات الزمنية لإشارات الكالسيوم من عناصر حجر الزاوية من اليرقات غير الجائعة ، N = 5 ، واليرقات الجائعة ، N = 5 ، في اليرقات الكاملة للتحضير في الجسم الحي. يقارن مخطط الصندوق في اللوحة اليمنى العلوية شدة إشارة الكالسيوم الطبيعية بين غير الجائعين باللون الرمادي ، والجوع في العينات البيضاء في المستحضر في الجسم الحي. اختبار مان ويتني يو ، P أقل من 0.001.

B ، تظهر اللوحة اليسرى السفلية خريطة حرارية تعرض متوسط ديناميكيات البوابة لإشارات الكالسيوم من Keystone LN من غير الجائع ، N = 5 والجائع N = 5 في الدماغ التشريح خارج الجسم الحي. يقارن مخطط الصندوق في اللوحة اليمنى السفلية شدة إشارة الكالسيوم الطبيعية بين العينات غير الجائعة والرمادية والجائعة والبيضاء في مستحضر الجسم الحي السابق. اختبار مان ويتني يو ب أقل من 0.001.

لإثبات نهج تصوير الكالسيوم اليرقي ، قمنا بتطبيقه بنجاح على كل من المستحضرات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي ليرقات ذبابة الفاكهة. في كلا المستحضرين ، لاحظنا نشاطا أعلى ل BLN الأساسي وعينات جائعة مقارنة بالعينات غير الجائعة. لوحظ هذا النشاط الأساسي العالي بوضوح في الخرائط الحرارية ، حيث عرض التمثيلات الزمنية للاستجابات على مدار 60 ثانية ، وفي مخططات صندوقية تصور متوسط قيم شدة الإشارة.

تتوافق هذه النتائج مع الدراسات الحديثة التي تظهر نشاطا أعلى للخلايا العصبية الشمية في الجائعة. كما هو موضح في هذا الفيديو ، يقلل لاصق الأنسجة GLUture بشكل كبير من القطع الأثرية للحركة في كل من الإعدادات داخل الجسم الحي وخارج الجسم الحي. يمكن أيضا تطبيق هذه الطريقة لدراسة أنواع مختلفة من المحفزات ، على سبيل المثال ، التطبيق الخارجي للروائح والانصهار الداخلي للمعدلات العصبية.