تقييم السلامة الميكروبية لمصانع الألبان باستخدام التنميط البروتيني البكتيري عبر نهج MALDI

طورنا بروتوكولا لتحضير وعزل المجتمعات الميكروبية عن منتجات يومية مختلفة، مثل الحليب والكريمة والزبدة والجبن. بمجرد عزله، يمكن التعرف على هذا الكائن الدقيقي بسرعة ودقة باستخدام متلازمة مالدي-توف. لا يزال تحسين ظروف الزراعة تحديا رئيسيا، إلى جانب فجوات في قواعد البيانات والجهد الصعب على استخراج البكتيريا الموجبة وتكوين الأبواغ. للبدء، احصل على عينة ممثلة من المنتج الألباني وامزجه جيدا لضمان التجانس.

بشكل غير منفسي، انقل ملليتر واحد أو غرام واحد من عينات صلبة إلى أنبوب طرد مركزي مخروطي بسعة 15 مليليتر يحتوي على تسعة ملليترات من وسط سائل معقم. قم بتدوير الأنبوب بقوة لمدة 30 إلى 60 ثانية لتحاسة العينة. بعد ذلك، جهز سلسلة من التخفيف بعشرة أضعاف عن طريق نقل ملليتر واحد من التعليق المتجانس إلى أنابيب متتالية، كل منها يحتوي على تسعة ملليترات من المحلول المعقم.

اخلط كل تخفيف جيدا عن طريق الدوامة أو الهز. ثم خذ 0.1 ملليلتر من العينة الأصلية، أو أحد التخفيفات المحضرة، وانقلها إلى سطح طبق بتري معد يحتوي على وسط الأجار المناسب. باستخدام موزع معقم، وزع اللقاح بالتساوي على سطح صفيحة الأجار.

للحضانة الهوائية، قم بتلقيح أطباق الأجار من APT، M17، CBL، MPCA، وTSA مع العينات المحضرة. حضن الصفائح تحت ظروف هوائية عند 37 درجة مئوية و30 درجة مئوية لمدة 24 ساعة. للحضانة اللاهوائية، ضع صفائح الأجار MRS المقطرة في غرفة لا هوائية وحضن عند 37 درجة مئوية و30 درجة مئوية لمدة 24 إلى 72 ساعة.

قم بإزالة الألواح من الحاضنة وفحصها يوميا لمراقبة نمو الميكروبات. باستخدام حلقة ميكروبية بسعة ميكرولتر واحد، قم برسم المستعمرات المختارة على نفس وسط الأجار لزراعتها الفرعية. حضانة تحت نفس الظروف المستخدمة سابقا.

لتحليل مطيافية الكتلة، ابدأ بتحضير حل مصفوفة MALDI. حضر خليط المذيب باستخدام 50٪ أسيتونيتريل و47.5٪ ماء بدرجة HPLC و2.5٪ حمض ثلاثي كلورو أسيتيك. قم بإذابة مركب المصفوفة في خليط المذيب إلى تركيز نهائي يقارب 10 ملليغرام لكل ملليتر.

لتحديد البكتيريا باستخدام طريقة النقل المباشر للمستعمرة، استخدم حلقة معقمة لنقل ميكرولتر واحد من مستعمرة بكتيرية ناضجة إلى نقطة على لوحة هدف MALDI. انشر المادة البكتيرية لتكوين طبقة رقيقة ومتساوية على اللوحة. بعد التجفيف، أضف لتر ميكرولتر من محلول مصفوفة HCCA على السطح ودعه يجف في الهواء عند درجة حرارة الغرفة.

لطريقة استخراج حمض الفورميك الهدفية، استخدم حلقة ميكروبية قابلة للتخلص أو عود أسنان معقم لجمع كمية صغيرة من الكتلة الحيوية البكتيرية من مستعمرة واحدة. دهن المادة مباشرة على نقطة في لوحة هدف MALDI لتكوين طبقة رقيقة ومتساوية. أضف ميكرولتر واحد من محلول حمض الفورميك بنسبة 70٪ فوق المنطقة الملطخة.

بعد أن تجف البقعة، ضع فوقها ميكرولتر واحد من محلول مصفوفة HCCA ودعها تجف في الهواء عند درجة حرارة الغرفة. لطريقة استخراج البروتين داخل الأنبوب، انقل مستعمرة إلى ثلاث مستعمرات كاملة من لوحة زراعة الأجار إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر يحتوي على 300 ميكرولتر من الماء المعقم. أضف 900 ميكرولتر من الإيثانول المطلق لتحقيق تركيز نهائي للإيثانول حوالي 75٪. بعد خلط المحتوى لفترة وجيزة، قم بطرد مركزي في الأنبوب لمدة دقيقتين عند 15,000 جرام في درجة حرارة الغرفة.

بعد ذلك، تخلص من المادة الفائقة بحذر دون إزعاج حبيبات الخلية. ثم أضف 20 إلى 50 ميكرولتر من حمض الفورميك بنسبة 70٪ إلى الحبيبات المجافة. اخلط المحتويات عن طريق التوصيل بالماصة أو الدوامة حتى يتم تعليق الحبيبة بالكامل.

الآن، أضف كمية متساوية من الأسيتونيتريل إلى تعليق حمض الفورميك وامزجه جيدا. قم بطرد الطرد المركزي على الأنبوب بقوة 15,000 جرام لمدة دقيقتين. انقل ميكرولتر واحد من المادة الفائقة الناتجة إلى نقطة محددة على صفيحة هدف MALDI ودعها تجف.

ثم ضع على البقعة المجففة محلول مصفوفة HCCA ميكرولتر واحد. بيبت ميكرولتر واحد من معيار اختبار البكتيريا الذي يحتوي على مستخلص من إشريكيا كولي DH5 ألفا أو معاير الأحياء الدقيقة الذي يحتوي على مستخلص بروتين E.coli ATCC 25922، والريبونوكلياز، والميوغلوبين. لاكتساب الأطياف وتحديد الميكروبات، جهز نقاط معايرة على لوحة هدف MALDI.

تحميل لوحة هدف MALDI مع كل من البقع المعلنة ونقاط المعايرة في جهاز مطيافية الكتلة. شغل تحليل المعايرة في وضع المعايرة لمعايرة النظام. تشغيل مطياف الكتلة في وضع الأيونات الموجبة الخطية لاكتساب الأطياف العامة.

ثم اضبط نطاق كشف الكتلة لمطياف الكتلة ليغطي من 2,000 إلى 20,000 نسبة كتلة إلى شحنة. احصل على الطيف المكرر لكل نقطة لتوليد ما لا يقل عن أربع نسخ تقنية لكل عينة. الآن، طبق طريقة سافيتزكي-غولاي كخوارزمية تنعيم.

استخدم خوارزمية TopHat لتصحيح الأساس لإزالة الضوضاء الخلفية. ثم اكتشف القمم باستخدام وضع المركز. رفع أطياف الكتلة المعالجة للعزلات البكتيرية غير المعروفة إلى منصة التعرف على الميكروبات داخل برنامج MALDI وتشغيل عملية التعرف.

قيم درجات التعريف وفقا لمعايير الحد الأدنى للمصنع. أظهرت أطياف الطيف الكتلي ملفات بروتينية خاصة بالنوع، مما أتاح التعرف على مستوى الجنس أو النوع. كشف مخطط الأشجار عن تشابه كبير لوحظ بين سلالات نفس النوع وتمايز واضح بين الأنواع.

أقصر وقت حضانة 12 ساعة لبكتيريا البكتر الأبواغي أنتج قيمة تقييم هوية أعلى تبلغ 2.38، بينما أدى الحضانة الأطول من 18 إلى 24 ساعة إلى انخفاض درجة التعرف على الهوية الهوائية بنسبة 1.85 بسبب سيطرة إشارات الأبواغ. من بين طرق تحضير العينة، أعطى استخراج البروتين داخل الأنبوب أعلى قيمة تقييم IDC وهي 2.23، تلاها استخراج حمض الفورميك عند 1.97 على الهدف، ونقل مباشر للمستعمرة، مما أدى إلى أدنى درجة بلغت 1.61. من خلال دمج علم الثقافة مع تحضير عينات مخصص، يتيح MALDI تحليلا أكثر دقة وسرعة للميكروبيوم بتكلفة أقل، مما ينتج نتائج مماثلة لطرق 16S rRNA المرجعية.

يتيح هذا البروتوكول المراقبة الروتينية وعالية الإنتاجية للكائنات الدقيقة في منتجات الألبان، مما يحسن سرعة الكشف ودقته، مما يعزز في النهاية جودة الغذاء وأنظمة السلامة. توسيع قواعد بيانات MALDI وأتمتة سير العمل في مختبرات الصناعة سيعزز التعرف على الميكروبات، ويزيد من معدل الإنتاجية، ويقلل الأخطاء، ويسرع مراقبة الميكروبيوتا.