تحضير العينة لدراسات التمثيل الغذائي لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية: غسل الخلايا المركبة والتبريد والتجفيف والتخزين

لقد طورنا بروتوكولات للحفاظ على سلامة المستقلبات الخلوية لدراسات قياس الطيف الكتلي أحادي الخلية. لقد بحثنا في كيفية تأثير ظروف الغسيل والتبريد والتخزين على مستقلبات الخلايا. تم تطوير طرق جديدة لتحضير العينات وتقنيات قياس الطيف الكتلي مؤخرا لتطوير دراسات التمثيل الغذائي أحادية الخلية لفهم عدم التجانس الخلوي وآليات المرض بشكل أفضل.

يحتاج الباحثون إلى التغلب على العديد من التحديات الرئيسية ، بما في ذلك كمية العينة المحدودة ، وانخفاض حساسية الكشف بسبب تعقيد العينة وتغيير المستقلبات بسبب تحضير العينة وتحليلها. نوضح تقنيات تحضير العينات الشاملة التي يمكن أن تحافظ على المستقلبات الخلوية وسلامة الخلية لدراسات التمثيل الغذائي لقياس الطيف الكتلي أحادي الخلية. يمكن أن توفر بروتوكولاتنا طريقة بسيطة وفعالة لإعداد وتخزين ونقل العينات لدراسات التمثيل الغذائي أحادية الخلية باستخدام تقنيات قياس الطيف الكتلي المختلفة.

للبدء ، احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة مرطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. راقب التقاء الخلايا يوميا ومررها عندما تصل المزارع إلى 80٪ من التقاء الجمع. للمرور ، استنشق الوسط من الطبق واشطفه مرة واحدة بخمسة ملليلتر من PBS.

احتضان الخلايا بملليلترين من 0.25٪ التربسين EDTA عند 37 درجة مئوية لمدة ثلاث دقائق لتسهيل انفصال الخلايا. قم بتحييد التربسين عن طريق إضافة ثمانية ملليلتر من الوسط الكامل الدافئ مسبقا والماصة برفق لتفريق الخلايا. انقل مليلتر واحد من المعلق إلى تسعة ملليلتر من الوسط الطازج الكامل لعد الخلايا.

لزرع الخلايا ، قم بتخفيفها إلى تركيز نهائي واحد في 10 بقوة ست خلايا لكل مليلتر. ضع غطاء زجاجي فردي مقاس 18 ملم في آبار صفيحة 12 بئر. أضف ملليلترين من الوسط الكامل و 200 ميكرولتر من معلق الخلية في كل بئر لتحقيق مرتين في 10 إلى قوة خمس خلايا لكل بئر.

احتضان الخلايا طوال الليل للسماح بالالتصاق. لغسل الخلايا ، أضف ملليلترين من محلول فورمات الأمونيوم البارد إلى كل بئر من لوحة 12 بئرا. ثم باستخدام ملقط معقم ، ارفع برفق كل زلة غطاء تحتوي على خلايا الالتصاق من بئرها وضعها لفترة وجيزة لمدة ثانيتين إلى ثلاث ثوان في بئر منفصل مملوء مسبقا بملليلتر من محلول فورمات الأمونيوم البارد 0.9٪.

ضع كل غطاء مغسول بفورمات الأمونيوم بحيث تكون الخلايا متجهة لأعلى في طبق بتري داخل وعاء من رقائق الألومنيوم. اسكب ببطء 10 إلى 20 مل من النيتروجين السائل على زلات الغطاء لضمان تغطية كاملة. وقم على الفور بإمالة طبق بتري بالملاقط لصب أي نيتروجين سائل متبقي.

باستخدام القفازات المبردة والملاقط المعزولة ، ضع طبق بتري الذي يحتوي على غطاء النيتروجين السائل في غرفة مكثف الفراغ. قم بمعالجة العينات باستخدام إعدادات التفريغ القياسية لمدة خمس إلى سبع دقائق حتى يتبخر النيتروجين السائل المرئي ويبدو الغطاء جافا. تأكد من أن زلات الغطاء المجففة لا تحتوي على أي نيتروجين سائل أو بلورات ثلجية متبقية.

بعد ذلك ، لف الحاوية بمنشفة ورقية وانقلها إلى ثلاجة 80 درجة مئوية لمدة 48 ساعة. بعد التخزين ، انقل زلات الغطاء التي تحتوي على طبق بتري إلى درجة حرارة الغرفة حتى تجف لمدة 10 دقائق. تأكد من اختفاء الصقيع المكثف أو الماء الموجود على انزلاقات الغطاء تماما قبل إزالتها من المجفف.

قسم العينات إلى مجموعتين وعاملها بشكل مناسب. الآن ، قم بتركيب المسبار الفردي على مرحلة XYZ وقم بتثبيته على مناور XYZ بمحرك موجود تحت المجهر الرقمي. قم بإقران إعداد المسبار الفردي بمطياف الكتلة لتحليل SCMS.

استخدم نتريل الأسيتون الذي يحتوي على 0.1٪ حمض الفورميك بنقاء لا يقل عن 99.9٪ كمذيب للاستخراج وقم بتسليمه بمعدل تدفق 150 نانولتر في الدقيقة باستخدام مضخة حقنة. قم بتعيين معلمات قياس الطيف الكتلي لأوضاع الأيونات الموجبة والسالبة. الآن ، ضع قسائم الغطاء من المجموعة الأولى والمجموعة الثانية معا في مرحلة XYZ الآلية لإعداد SCMS للمسبار الفردي واستخدم المجهر لاختيار الخلايا بشكل عشوائي لتحليلها.

بعد الحصول على أطياف الكتلة ، قم بتحليل ما يقرب من 30 خلية لكل مجموعة باستخدام نفس المسبار الفردي ومعدل تدفق المذيبات وجهد التأين. تمت معالجة بيانات SCMS الأولية مسبقا باستخدام برنامج R نصي مخصص وتطبيق إزالة الخلفية والضوضاء متبوعا بتطبيع شدة الأيونات على إجمالي تيار الأيونات. قم بإزالة نظائر بيانات SCMS باستخدام نظير حزمة Python MSD.

قم بإجراء محاذاة الذروة باستخدام برنامج نصي Python داخلي. قم بتطبيق عرض الحاوية بنسبة شحن رئيسية تبلغ 0.01 للتجميع وتفاوت كتلة بنسبة شحن رئيسية 0.01 أو خمسة أجزاء في المليون لمحاذاة الذروة. قم بإجراء تحليل البيانات الإحصائية باستخدام Metabo Analyst 6.0.

قم بإجراء اختبار T وإنشاء خريطة حرارية توضح مستويات المستقلب النسبية. حدد الخيار المستخدم أعلى 100 و T-test أو Inova لإنشاء أفضل 100 مستقلب مرتبة حسب الأهمية ورسم خريطة حرارية باستخدام أفضل 100 مستقلب مع اختلافات كبيرة. أخيرا ، ابحث عن قيم الشحن الرئيسية الدقيقة مقابل قاعدة بيانات الأيض البشري باستخدام تحمل كتلة يبلغ 10 أجزاء في المليون للبحث في قاعدة البيانات.

أظهر تحليل المكون الرئيسي في وضع الأيونات الإيجابية أن المجموعة الأولى والمجموعة الثانية متداخلة بشكل وثيق ، مما يشير إلى ملامح مستقلبات متشابهة للغاية. في وضع الأيونات السالبة ، لوحظ نمط مماثل ، على الرغم من أن المجموعة الثانية بدت أكثر وضوحا قليلا. أظهر تحليل الخريطة الحرارية لأفضل 100 مستقلب أنماط وفرة متسقة للغاية بين المجموعة الأولى والمجموعة الثانية في كلا الوضعين الأيونيين.

لم يلاحظ أي تحولات رئيسية أو تجميع خاص بالمجموعة. على الرغم من أن الاختلافات الطفيفة في عدد قليل من مجموعات المستقلب قد تعكس اختلافات في كفاءة التأين أو استقرار المستقلب.