Name: أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2008-03-28T01:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: تعلم تقنية ترسيط الأكتين المشترك لتحليل تفاعلات البروتينات مع الأكتين الخيطي في المختبر. توفر هذه الطريقة دليلاً عملياً لدراسة الهيكل الخلوي الديناميكي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

أشكر لك الدكتور برافين كومار في المختبر ويتمان في سان فرانسيسكو للفيلم من الأكتين في الخلايا HaCAT.

1. إعداد أكتين وكان مصدر أكتين المستخدمة في هذا الاختبار غير العضلات الصفائح الدموية البشرية (β - أكتين) تم الحصول عليها من أسهم شركة aliquots الهيكل الخلوي في 10 يتم الاحتفاظ ملغ / مل في الثلاجة -70 درجة مئوية. للفحص ، هو المخفف للأكتين إلى 0.4 ملغ / مل في منطقة عازلة تحتوي على 5 ملم تريس الرقم الهيدروجيني 8 ، 0.2 ملم CaCl 2 ، 0.2 و 0.5 ملي ATP DTT ملم ، في طرد 20000 لمدة 10 دقيقة ز عند 4 درجة مئوية. وطاف ، وهو أكتين موحودي جاهزة للبلمرة. هي التي يسببها أكتين البلمرة من بوكل إضافة 50 مم ، و 1 و 2 ATP ملي ملي MgCl 2. وتحدث البلمرة في درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة. 2. التحضير للبروتين في هذا الاختبار ، ونحن باستخدام C - محطة من تالين ، الذي كان بمثابة تنقية البروتين GST الموسومة. يخضع هذا البروتين لاستخدامها في مقايسة إلى الطرد المركزي عالية السرعة لمسح ما قبل المجاميع قبل الحضانة مع أكتين - F. هو نسج من البروتين في 100000 ز في نابذة فائقة السرعة لمدة 20 دقيقة بيكمان في 22 درجة مئوية. 3. أكتين البروتين الحضانة فإن كمية الأكتين والبروتين في مقايسة تختلف. في هذا المثال نحن نستخدم أكتين في الزائدة. عادة ، يتم حساب نسبة المولي ، على سبيل المثال. نسبة 4:01 من المولي لأكتين البروتين. في مقايسة التالية ، وحجم رد الفعل النهائي هو 150 ميكرولتر. سوف العازلة التي يتم تحضين البروتين و F - أكتين تعتمد على البروتين لفحصها ، وعلى الشروط المطلوبة. في هذا المثال ، نستخدم العازلة التي تحتوي على 10 ملي تريس الرقم الهيدروجيني 7.0 ، 1 ATP ملي و 0.2 ملي DTT ، 1 EGTA ملم ، 0.1 ملم CaCl 2 و 2 مم MgCl 2. يتم تحضين البروتين و F - أكتين في المنطقة العازلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة. 4. الترسيب من طراز F - أكتين بعد الحضانة ، ونسج على عينات 100000 ز في 22 درجة مئوية. نستخدم نابذة فائقة السرعة بيكمان في الفيديو. تتم إزالة الدوار بعناية حتى لا تعكر صفو الكريات. 5. تحليل البروتين المشترك الترسيب مع F - أكتين تتم إزالة بعناية من قبل supernatants pipetting في أنبوب إيبندورف و 5 X Laemmli العازلة عينة SDS - PAGE يضاف. يضاف إلى حجم مناسب من 1 العازلة Laemmli X عينة SDS - PAGE إلى الكريات المتبقية ، pipetted صعودا وهبوطا ، ونقل إلى أنابيب إيبندورف جديدة. ويتم تحليل الكميات النسبية للبروتين في كريات supernatants وبعد الانفصال من جانب وSDS - PAGE Coomassie الأزرق تلطيخ من هلام أو النشاف الغربية. ويمكن من أجل تحديد خصوصية التفاعل مع أكتين البروتين ، يمكن تنفيذ الأكتين التي تعتمد على تركيز التعاون الترسبات. يتم تحضين لهذا النوع من التجربة ، وهو مبلغ ثابت من البروتين ، وسلسلة من كميات متزايدة من الأكتين ، والذي أجري على النحو المبين أعلاه.

<ol><li>Senetar, M. A., Foster, S. J., McCann, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrasteric+inhibition+mediates+the+interaction+of+the+I%2FLWEQ+module+proteins+Talin1%2C+Talin2%2C+Hip1%2C+and+Hip12+with+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Intrasteric inhibition mediates the interaction of the I/LWEQ module proteins Talin1, Talin2, Hip1, and Hip12 with actin.</a> Biochemistry. 14, 15418-15428 (2004).</li>
<li>Goldmann, W. H., Hess, D., Isenberg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+intact+talin+and+talin+tail+fragment+on+actin+filament+dynamics+and+structure+depends+on+pH+and+ionic+strength%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">The effect of intact talin and talin tail fragment on actin filament dynamics and structure depends on pH and ionic strength.</a> Eur J Biochem. 260, 439-445 (1999).</li>
<li>Lee, H., Bellin, R. M., Walker, D. L., Patel, B., Powers, P., Liu, H., Garcia-Alvarez, B., de Pereda, J., Liddington, R. C., Volkmann, N., Hanein, D., Critchley, D. R., Robson, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+an+Actin-binding+Site+within+the+Talin+FERM+Domain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Characterization of an Actin-binding Site within the Talin FERM Domain.</a> J Mol Biol. 22, 771-784 (2004).</li>
</ol>

أكتين المشترك الترسيب هو بسيط في فحص المختبر لتحليل البروتينات specfic ملزمة لأكتين - F. في هذا الفيديو ، ونظهر مثال واحد بسيط كيف أكتين المشترك الترسيب يمكن الاضطلاع بها. نعرض كيفية تحضير F - أكتين ، وإعداد هذا البروتين لفحصها وإجراء أكتين المشترك الترسيب. وينبغي النظر في عدد من النقاط عند تنفيذ أكتين المشترك الترسيب المقايسات. على سبيل المثال ، يمكن للمكونات عازلة للحضانة تختلف تبعا للبروتين لفحصها ودرجة الحموضة ودرجة الحرارة وتركيز الملح قد يؤثر على ملزمة لأكتين - F. لقد أثبتنا ملزم بسيطة لF - أكتي...

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لf - أكتين

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

الهيكل الخلوي أكتين داخل الخلية هو عبارة عن شبكة من خيوط الأكتين الذي يسمح للحركة الخلايا والعمليات الخلوية ، والتي تولد التوتر ويساعد في شكل يحافظ الخلوية. على الرغم من أن الهيكل الخلوي أكتين هو بنية جامدة ، بل هو بنية ديناميكية التي يتم إعادة عرض باستمرار. ويمكن لعدد من البروتينات ربط الهيكل الخلوي أكتين. هو المطلوب في كثير من الأحيان ملزمة من بروتين خاص لأكتين - F لدعم الملاحظات الخلية أو البيولوجية لتعزيز فهم العمليات الحيوية نتيجة لإعادة تشكيل الهيكل الخلوي أكتين. شارك في فحص الترسيب أكتين هو المختبر في فحص روتيني لتحليل الملزمة للبروتينات معينة أو المجالات البروتين مع أكتين - F. المبادئ الأساسية للمقايسة تنطوي على حضانة للبروتين من الفائدة (الطول الكامل أو مجال) مع F - أكتين ، خطوة تنبيذ فائق لتكوير F - أكتين وتحليل البروتين المترسبة التعاون مع أكتين - F. ويمكن تصميم أكتين المشترك الترسيب المقايسات وفقا لقياس أكتين الانتماءات الملزمة والمقايسات في المنافسة.

البروتينات ربط أكتين الخيطية (F - أكتين) من خلال وحدات أكتين متميزة ملزمة. في هذا الفيديو نبدي الداخلي أكتين شارك في الترسيب ، وهو المختبر في فحص روتيني لتحليل البروتينات أو المجالات المحددة التي تربط F - أكتين.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

يُعد الهيكل الخلوي الأكتيني داخل الخلية شبكة من خيوط الأكتين التي تسمح بحركة الخلايا والعمليات الخلوية، وتعمل على توليد...

داخل الخلية. يُعد هيكل الأكتين الخلوي بنية ديناميكية، وتعتبر عملية إعادة تشكيله مهمة في مجموعة متنوعة من العمليات، بدءاً من انقسام الخلية وهجرتها وصولاً إلى النقل الفيزيائي. ويمكن لمجموعة واسعة من البروتينات أن ترتبط بهيكل الأكتين الخلوي من خلال وحدات ربط أكتين متميزة.نستعرض في هذا الفيديو إجراء الترسيب المشترك للأكتين، وهو مقايسة في المختبر تُستخدم بشكل روتيني لتحليل البروتينات أو نطاقات بروتينية محددة ترتبط بالأكتين الخيطي. مرحبًا، أنا جودي فار من مختبر الدكتورة ديان باربر في قسم بيولوجيا الخلية والأنسجة بجامعة كاليفورنيا في سان فرانسيسكو (UCSF). سأوضح لكم في هذا الفيديو إجراء كيفية تنفيذ مقايسة الترسيب المشترك للأكتين.تعد هذه العملية إحدى الطرق لتحليل البروتينات التي ترتبط تحديداً بالأكتين الخيطي، ويمكن استخدامها لقياس ألفة الارتباط. تتضمن هذه العملية الخطوات التالية: تكوين خيوط الأكتين وتحضير البروتين المراد اختباره، ثم تحضين البروتين المستهدف مع الأكتين الخيطي (أو f actin اختصاراً)، وترسيب F actin عن طريق الطرد المركزي الفائق عند 100,000 ×g، وأخيراً إجراء SDS page والصبغ بـ کوماسي (coomassie) لتصور أجزاء السائل الطافي والراسب.وأخيرًا، تحليل البروتين الذي يترسب مع f actin في جزء الرواسب. لذا، لنبدأ. من أجل تحضير خيوط الأكتين، يُنصح بالتأكد من أن الأكتين الذي نعمل معه هو في شكل المونيمر.يتم إخراج محلول مخزون من actin بتركيز 10 M per mil من المجمد عند درجة حرارة 80- درجة مئوية، ويُحضّر تخفيف عمل بتركيز 2.4 mgs per mil في محلول منظم يحتوي على tris وكلوريد الكالسيوم، وATP لتثبيت المونومر وDTT. يوضع تخفيف العمل على الثلج لمدة ساعة واحدة، وبعد فترة الحضانة هذه على الثلج، يتم إجراء عملية طرد مركزي لمحلول actin بسرعة 14,000 RPM لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.سيكون السائل الطافي الناتج هو المونومرات من الأكتين. والآن، يمكن توليد خيوط الأكتين من مونومرات الأكتين المنقاة هذه عن طريق إضافة كلوريد البوتاسيوم، وكلوريد المغنيسيوم، وTP لمدة ساعة واحدة. وفي درجة حرارة الغرفة، تصبح خيوط الأكتين الآن جاهزة للتحضين مع البروتين أو نطاق البروتين المطلوب، وهو ما سنوضحه لكم في الخطوة التالية.للمضي قدماً في مقايسة الترسيب المشترك للأكتين، يجب علينا تحضير البروتين المراد اختباره. أستخدم اليوم بروتين clan، الذي تم تنقيته كبروتين اندماجي GSC. وقد تم تنقية البروتين مسبقاً من التجمعات عن طريق الطرد المركزي الفائق، وأصبح السائل الطافي الناتج جاهزاً الآن للاستخدام في المقايسة.من أجل اختبار ارتباط البروتين بالأكتين، يجب أن يكون الأكتين فائضاً. في هذه الحالة، يتم تحضين 10 micrograms من الأكتين مع خمسة micrograms من البروتين في محلول منظم يحتوي على tris و ATP و BT ME و capto ethanol و ETTA وكلوريد الكالسيوم، وذلك للوصول إلى حجم إجمالي قدره 150 microliters لتحضين البروتين والأكتين. تُجرى عمليات التحضين مباشرة في أنابيب طرد مركزي فائقة السرعة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تمثل الأنبوبتان الأولى والثانية مجموعات ضابطة؛ حيث يحتوي الأنبوب الأول على الأكتين فقط في المحلول المنظم.تحتوي الأنبوبة رقم اثنان على البروتين فقط في المحلول المنظم. وتحتوي الأنبوبة رقم ثلاثة على كل من actin وCNU لبروتين talin في المحلول المنظم رقم اثنان. أما الأنبوبة رقم أربعة فهي ضابط إضافي للارتباط غير النوعي، وتحتوي على actin وبروتين GST وحدهما. وبعد فترة تحضين مدتها ساعة واحدة، يتم وضع العينات بعناية في جهاز الطرد المركزي Beckman.بعد ذلك، قمنا بضبط جهاز الطرد المركزي الفائق عند 100,000 ×g وتشغيل العينات لمدة 20 دقيقة عند 22 °C. وبعد عملية الطرد هذه، تمكنا من تحضير عيناتنا للتشغيل على SDS page. وعقب عملية الطرد التي استمرت 20 دقيقة، يتم إخراج العينات بعناية من الدوار لضمان عدم تعكر الراسب. ثم يتم وضع علامة على جانب الأنبوب في موضع وجود الراسب.يتم نقل السائل الطافي بعناية إلى أنابيب إيبندورف مضاف إليها 5 µL من منظم عينات XSCS. يضاف 1 µL من منظم عينات XSCS إلى الراسب المتبقي في أنابيب جهاز الطرد المركزي الفائق. وبعد إجراء عملية السحب والضخ (pipetting) للأعلى والأسفل، يتم نقل الراسب المعلق المعاد تعليقه إلى أنبوب إيبندورف جديد.يتم بعد ذلك غلي العينات في وحدة تسخين لمدة تصل إلى 10 دقائق. وبعد الغليان، يتم تحميل العينات على هلام SDS page. في هذه التجربة، سأستخدم هلاماً بتركيز 10% مُعداً مسبقاً.يتم تحميل العينات بعناية في الآبار بالترتيب الصحيح. يتم تشغيل الهلام بجهد كهربائي ثابت لمدة ساعة واحدة تقريبًا في درجة حرارة الغرفة. وبعد انتهاء تشغيل الهلام، نقوم بصبغه بـ kumasi blue لتصوير البروتينات.يجب أن تغطي محاليل كوماسي الزرقاء (Kumasi blue) الهلام بالكامل. يُترك الهلام في جهاز هزاز لمدة 20 دقيقة على الأقل، ثم يُزال محلول ESI الأزرق ويُغمر الهلام في محلول إزالة الصبغة (detain solution).يُترك الهلام لمدة ساعة واحدة تقريباً على جهاز هزاز حتى تظهر الحزم في الهلام. بعد الصبغ بصبغة كوماسي، يمكن تحليل الهلام لتحديد الكمية النسبية للبروتين في أجزاء الراشح مقابل أجزاء الراسب. وبالنظر إلى الهلام الذي تم تحضيره في المسارين الأول والثاني، يمكننا رؤية أجزاء الراشح والراسب لبروتين acton وحده.في الحارتين الثالثة والرابعة، كانت لدينا كسور الراشح والرواسب لبروتين C teer tailn وحده. وفي الحارتين الخامسة والسادسة، كانت لدينا كسور الراشح والرواسب لبروتين acton و C of tail بعد الحضن. وفي الحارتين السابعة والثامنة، كانت لدينا كسور الراشح والرواسب لبروتين actin وبروتين GST بعد الحضن.كما تلاحظون، فإن CT الخاص بالذيل يظهر فقط في جزء الحنك في المسار السادس. تشير نتائج هذا الهلام إلى ارتباط محدد للطرف C، أي الذيل، بـ acton. في هذا الفيديو، شاهدتم كيفية إجراء مقايسة الترسيب المشترك لـ Acton.تعد فحوصات الترسيب المشترك للأكتين (Actin co-sedimentation assays) طريقة مخبرية لتحليل البروتينات الرابطة للأكتين. وعند إجراء هذا الإجراء، من المهم تذكر هذه النقاط: يجب إجراء تنقية مسبقة (pre-clear) للبروتين المستهدف لتضمين ضابط سلبي يتكون من البروتين وحده لكل عملية تحضين للأكتين مع البروتين.ستبين هذه الضابطة ما إذا كان أي من البروتينات التي تم تنقيتها مسبقاً يترسب من تلقاء نفسه، حيث إن ارتباط البروتينات بـ f يمكن أن يتأثر بدرجة الحموضة pH أو درجة الحرارة أو تركيز الملح في المحلول المنظم. وهذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم ونتمنى لكم التوفيق في تجاربكم.

actin-co-sedimentation-assay-for-analysis-protein-binding-to-f

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

نحن نطبق التسمية خالية من تحليل التفاعل البروتين باستخدام X100 Biacore للهيكل وظيفة تحليل الربط العديد من المسوخ B cystatin إلى غراء من خلال توصيف الحركية. المعايرة خالية من التحليل تركيز (CFCA) يقيس تركيز البروتين مع النشاط ملزم الاحتفاظ دون الحاجة إلى منحنى القياسية. نظهر أن تأكيد باستخدام تركيزات CFCA يزيد من مصداقية هذا التحليل الحركي ويمكن أن يعتمد عليه أن يحدد الثوابت الحركية حتى إذا تم خفض نشاط بروتين المؤتلف.

على أهمية تركيز البروتين الصحيح لحركية وتقارب في تحديد هيكل وظيفة التحليل

يصف هذا الفيديو تقنية دراسة الهيكل الخلوي والتصاقات البؤرية في خلايا سرطان القولون البشري الأولية لفهم اختلافاتها اعتمادا على صلابة الركيزة. تسمح هذه الثقافة للخلايا السرطانية على ركائز ناعمة وصلبة بإجراء قياسات فيزيائية حيوية مختلفة لتشخيص السرطان.

فحص الهيكل الخلوي وتنظيم الالتصاق البؤري: طريقة قائمة على التألق المناعي لدراسة التصاق الخلايا وانتشارها على الركائز

بلمرة FtsZ ضرورية لانقسام الخلايا البكتيرية. في هذا التقرير ، نقوم بتفصيل بروتوكولات بسيطة لمراقبة نشاط بلمرة FtsZ ومناقشة تأثير تكوين المخزن المؤقت. يمكن استخدام البروتوكولات لدراسة تفاعل FtsZ مع البروتينات التنظيمية أو الأدوية المضادة للبكتيريا التي تؤثر على بلمرة FtsZ.

FtsZ البلمرة فحوصات: بروتوكولات بسيطة واعتبارات

يصف هذا البروتوكول طريقة لاختبار قدرة البروتين للمشاركة في الرواسب مع أكتين الخيطية (F- أكتين)، وإذا لوحظ ملزم، لقياس تقارب التفاعل.

قياس البروتين ملزمة ل F- أكتين بواسطة الترسيب المشترك

مهام دخلول المبكر تعتمد على بلمرة الأكتين و. هنا، يمكننا وصف القائم على الفحص المجهري في المختبر مقايسة التي ريكونستيتوتيس على التنو وبلمره الأكتين و على الأغشية اندوسومال المبكر في أنابيب الاختبار، مما يجعل هذه سلسلة معقدة من التفاعلات قابلة للكيمياء الحيوية والوراثية التلاعب.

في المختبر بلمرة الأكتين و في وقت مبكر اندوسوميس

نحن نبلغ عن فحص بسيط وفعال للوقت وعالي الإنتاجية يستند إلى التحليل الطيفي للتحديد الكمي لخيوط أكتين في عينات بيولوجية من أنسجة الدماغ للقوارض والموضوعات البشرية.

مطياف مفلور فعال من حيث الوقت لتقييم حالة البلمرة في القوارض وأنسجة الدماغ البشرية

للتقدم، يجب أن تمارس مخاريط النمو قوى جذب ضد البيئة الخارجية. جيل قوى الجر يعتمد على ديناميات أكتين واقتران مخلب. وتصف هذه الدراسة أساليب لتحليل ديناميات أكتين، اقتران مخلب وقوى الجر للتقدم مخروط النمو.

تحليلات أكتين دايناميكز، اقتران مخلب وقوة الجر للنمو مخروط مقدما

يصف هذا البروتوكول تكوين طبقات ثنائية دهنية مدعومة وإضافة خيوط هيكلية خلوية وبروتينات حركية لدراسة ديناميكيات الشبكات الهيكلية الخلوية المعاد تشكيلها والمربوطة بالغشاء باستخدام الفحص المجهري الفلوري.

إعادة تكوين قشرة الأكتين الدنيا المربوطة بالغشاء على الطبقات الثنائية الدهنية المدعومة

يصف هذا البروتوكول كيفية إنتاج مذنبات الأكتين على أسطح الخرز باستخدام مكونات البروتين المتاحة تجاريا. تحاكي هذه الأنظمة الهياكل البارزة الموجودة في الخلايا ، ويمكن استخدامها لفحص الآليات الفسيولوجية لإنتاج القوة بطريقة مبسطة.

إعادة تكوين الحركة القائمة على الأكتين مع البروتينات المتاحة تجاريا

تصف هذه الطريقة مقايسة الترسيب في المختبر القائمة على الليكتين لتحديد تقارب الارتباط بين فوسفاتيز الجلوكان والأميلوبكتين. يمكن الاعتماد على اختبار الترسيب المشترك هذا لقياس ارتباط ركيزة الجلوكان الفوسفاتيز ويمكن تطبيقه على ركائز الجلوكان المختلفة القابلة للذوبان.

مقايسة الترسيب القائمة على Concanavalin A لقياس ارتباط الركيزة لفوسفاتاز الجلوكان

هنا ، نقدم طرقا لتحضير مجموعات الأكتين البلورية السائلة شبه ثنائية الأبعاد (2D) المتشابكة والمتشابكة والمتصالبة من البروتينات المنقاة.

ضبط أوضاع الانقباض والتشوه للتجميعات النشطة القائمة على الأكتين في المختبر: من الشبكات النشطة ثنائية الأبعاد إلى قطرات البلورات السائلة

تعلم تقنية ترسيط الأكتين المشترك لتحليل تفاعلات البروتينات مع الأكتين الخيطي في المختبر. توفر هذه الطريقة دليلاً عملياً لدراسة الهيكل الخلوي الديناميكي.

أكتين المشارك الترسيب الفحص ، وبالنسبة للتحليل البروتين ملزمة لF - أكتين

استكشف المزيد من الفيديوهات