تصور حارس البوابة: تقييم إيفان القائم على الصبغة الزرقاء لنفاذية حاجز الدم والدماغ في أسماك الزرد البالغة

يركز هذا البحث على تطوير طريقة موثوقة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفة لتقييم سلامة الحاجز الدموي الدماغي في أسماك الزرد البالغة. لا تحتوي معظم دراسات أسماك الزرد على طريقة سهلة وموثوقة لقياس اضطراب الحاجز الدموي الدماغي ، وغالبا ما تكون الطرق الحالية معقدة أو مكلفة. لذلك يقدم هذا البروتوكول حلا عمليا وبأسعار معقولة.

هذا البروتوكول بسيط وفعال من حيث التكلفة ويجمع بين التحليل المرئي والقابل للقياس ، كل ذلك دون الحاجة إلى معدات باهظة الثمن أو خطوات معقدة. من خلال توفير بروتوكول بسيط وقابل للتكرار ، سيسهل على المختبرات استكشاف التغيرات العصبية الوعائية في نماذج مرض الزرد البالغة. للبدء ، قم بتخدير الزرد عن طريق خفض درجة حرارة الماء تدريجيا من 12 درجة مئوية إلى سبع درجات مئوية حتى لا تستجيب الأسماك للمنبهات اللمسية.

باستخدام حقنة الأنسولين قياس 31 ، قم بحقن 20 ميكرولتر من صبغة إيفانز الزرقاء 1٪ ، أو صبغة EB ، في تجويف السمكة داخل الصفاق ، واضغط برفق في موقع الحقن لمدة 10 ثوان لمنع التدفق العكسي. الآن انقل الأسماك إلى خزان الاسترداد واترك الاسترداد لمدة 30 دقيقة. راقب الأسماك بحثا عن الإصابة أو الوفيات أو التغيرات السلوكية خلال هذا الوقت.

لإنشاء تحكم إيجابي ، قم بإعداد إبرة معقمة قياس 31 متصلة بحقنة الأنسولين لإجراء إجراء إصابة جرح طعنة. بعد فترة نقاهة مدتها 30 دقيقة ، قم بتخدير السمكة مرة أخرى ، كما هو موضح سابقا. ضع السمكة في وضع مستقيم على سطح مستو وبارد ، مثل كيس جل الثلج.

أدخل الإبرة في جانب واحد من الرأس بزاوية 90 درجة على عمق لا يتجاوز 1.5 ملم. ثم انقل السمكة إلى خزان الاسترداد واتركها تتعافى لمدة 30 دقيقة. بعد القتل الرحيم للأسماك عن طريق انخفاض حرارة الجسم ، استخدم شفرة معقمة أو مقصا جراحيا لقطع رأس السمكة التي تم قتلها رحيما.

اشطف الرأس مرتين في 1X PBS باستخدام نسبة 1:20 من الأسماك إلى PBS لإزالة الدم الزائد وصبغة إيفانز الزرقاء. ثم قم بتثبيت الرأس في 4٪ بارافورمالديهايد باستخدام نسبة 1:20 من الأسماك إلى المثبت ، واحتضان عند أربع درجات مئوية طوال الليل. ضع الرأس الثابت في طبق بتري نظيف وقم بتشريح الدماغ باستخدام ملاقط مدببة.

أضف PBS باستمرار بالتنقيط أثناء التشريح للحفاظ على ترطيب الأنسجة ومنع الجفاف. اشطف الدماغ المقطوع مرتين في حمامين منفصلين من PBS وضع المنديل على صفيحة agarose بنسبة 1٪ للاحتفاظ بالرطوبة ومنع الانكماش. راقب أنسجة المخ المشرحة تحت مجهر ستيريو.

لبدء التحليل الكمي ، قم بتنزيل برنامج فيجي وتثبيته وافتح ملف صورة الدماغ في فيجي. قم بإجراء إزالة الالتفاف اللوني عن طريق تحديد Image، متبوعا باللون وإزالة الالتفاف اللوني واختيار RGB. سينتج عن ذلك ثلاث صور منفصلة تمثل درجات اللون الأحمر والأخضر والأزرق.

الآن ، قم بتنشيط صورة القناة الزرقاء ، وعادة ما تسمى اللون 3 ، بالنقر فوق الصورة. قم بتحويله إلى تدرج رمادي 8 بت عن طريق تحديد صورة، متبوعا بالنوع و 8 بت. بعد ذلك ، لقياس شدة اللون الرمادي للصورة 8 بت ، قم بتعيين معلمات القياس عن طريق تحديد تحليل وتعيين القياسات.

ثم اختر المنطقة ويعني القيمة الرمادية. باستخدام أداة تحديد المستطيل، ارسم منطقة اهتمام ذات حجم موحد وقم بقياس شدة اللون الرمادي عن طريق تحديد تحليل، متبوعا بقياس أظهر الزرد العادي لون بشرة بني نموذجي ، وأظهر الزرد المحقون ب EB لونا مزرقا ملحوظا.

للتحقيق في سلامة الحاجز الدموي الدماغي في نموذج باركنسون لأسماك الزرد البالغة ، تمت مقارنة تسرب صبغة EB في أنسجة المخ بين التحكم المحقون بالمحلول الملحي وسمك الزرد باركنسون. في المجموعة الضابطة السلبية ، ظهرت الأوعية الدموية في الدماغ حمراء ، مما يشير إلى عدم وجود تسرب صبغة EB. في المقابل ، أظهرت مجموعات التحكم المحقونة بالمحلول الملحي ، والتحكم الإيجابي ، ومجموعات باركنسون لونا مزرقا في الأوعية الدموية في الدماغ ، مما يؤكد الدورة الدموية الجهازية الناجحة لصبغة EB.

بدت الأدمغة المشرحة من المجموعة الضابطة السلبية بيضاء مع أوعية دموية مرئية بوضوح ، مما يؤكد عدم وجود تلطيخ EB. في مجموعة إصابات التحكم الإيجابي ، أشار اللون الأزرق المكثف المحيط بأنسجة المخ إلى تسرب الصبغة بسبب اضطراب الحاجز الدموي الدماغي المتعمد. في المجموعة المحقونة بالمحلول الملحي ، ظل تلطيخ EB محصورا في الأوعية الدموية ، مما يشير إلى وجود حاجز دموي في الدماغ سليم.

أظهرت مجموعة مرضى باركنسون نمط تلطيخ أزرق أغمق وأكثر انتشارا ، مما يشير إلى تسرب كبير لصبغة EB واختراق حاجز الدم في الدماغ. كشف التحليل الكمي للتدرج الرمادي عن قيم كثافة رمادية أقل بشكل ملحوظ في مجموعة باركنسون مقارنة بالمجموعة المحقونة بالمحلول الملحي.