طفرات العاثية الدقيقة مع أنظمة CRISPR-Cas بمساعدة NgTET

ندرس عدوى العاثيات على المستوى الجزيئي. هذا حقا علم أساسي. ومع ذلك ، فنحن لا نقوم بالعلوم الأساسية فحسب ، بل نحرص أيضا على ترجمة هذا العلم الأساسي إلى تطبيقات حيث نستخدم هذه المعرفة لدراسة عدوى العاثيات ، واستخدامها في هندسة العاثيات ، وللتطبيقات العلاجية.

أحد أحدث التطورات في مجال أبحاث العاثيات هو اكتشاف جهاز المناعة البكتيري. هذا الجهاز المناعي موجود في جميع البكتيريا وقد حددوا أو يولدون أدوات لمحاربة العاثية حقا. ومع ذلك ، فإن العاثية ذكية جدا.

كان العاثية قادرا على تحديد الأدوات أيضا وتطوير الأدوات التي تسمح له بالهروب من أجهزة المناعة هذه. وإحدى الأدوات هي في الواقع تعديل الحمض النووي الخاص به عن طريق التعديل. وهذا مثير للاهتمام حقا بالنسبة لنا بشكل خاص لأن دراسة الطبيعة الكيميائية لتعديلات الحمض النووي هذه التي ولدتها العاثيات للهروب من جهاز المناعة أمر مثير للاهتمام حقا ، ويسمح لنا أيضا بأن نصبح أداة لهندسة العاثية في النهاية.

في السنوات العشر الماضية ، تم تطوير تقنيات رائعة من قبل زملاء رائعين في جميع أنحاء العالم. إحدى هذه التقنيات هي على سبيل المثال ، تسلسل الجيل التالي. بناء على هذه التقنية ، يمكننا حقا تسلسل العاثية ، ولكن أيضا جينومات المضيف بأكملها على المستوى الجزيئي.

من ناحية أخرى ، تم تطوير قياس الطيف الكتلي ، شيء مثل البروتينات. كريسبر هي أداة رائعة يتم تطبيقها الآن في ممالك الحياة المختلفة. وأيضا نحن نستخدم هذا الآن لهندسة جينوم العاثية.

هذه ليست سوى عدد قليل من التقنيات الرائعة التي أعادت تشكيل طريقة تفكيرنا في العاثيات اليوم. عندما نتحدث عن التحديات الحالية ، فإن أحد التحديات التي نراها هو كريسبر الحيوية الهندسية لجينوم العاثية. يتم تعديل جينوم العاثية بالكامل مع تعديلات الحمض النووي ، ولا تستطيع ACEs النووية CRISPR في الواقع شق الحمض النووي.

لذلك هذا حقا تحد نحتاج إلى التغلب عليه إذا أردنا هندسة جينومات العاثيات البكتيرية. اكتشفت مجموعتي لبنة بناء جديدة تماما من الحمض النووي الريبي. اكتشفنا أن نسخا محددة تحمل في نهايتها الرئيسية الخمسة ، ما يسمى بشبح الأكسدة والاختزال ، نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد قصير NAD ، واكتشفنا هذا أيضا مؤخرا الآن لأول مرة في تفاعلات العاثية E-coli T4.

بناء على هذا الاكتشاف ، حددنا أيضا أن الحمض النووي الريبي والبروتينات يمكن أن تتفاعل مع بعضها البعض بطريقة جديدة تماما. اكتشفنا أن NAD الذي وصفته من قبل يعمل مثل غراء الجزيء لربط الحمض النووي الريبي والبروتينات ببعضها البعض. ابتهاج الحمض النووي الريبي هذا هو طريقة جديدة تماما لكيفية تفاعل الحمض النووي الريبي والبروتينات مع بعضها البعض في الطبيعة.

وقد حققنا هذا الاكتشاف في التفاعل البيئي المضاد للعاثيات. نحن حريصون الآن أيضا على ترجمة هذا العلم الأساسي إلى تطبيقات ، على سبيل المثال ، في مجال العلاجات القائمة على الحمض النووي الريبي. للبدء ، عالج 500 ميكرولتر من تعليق العاثيات ب 20 وحدة من الحمض النووي 1.

أضف ميكرولتر من الحمض النووي الريبي AT1 ممزوج إلى الأنبوب. احتضن الخليط المعالج على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. بعد ذلك ، قم بتحميل 500 ميكرولتر من محلول العاثية المعالج فوق تدرج السكروز المحضر.

قم بالطرد المركزي للتدرج عند 70 ، 000 جم لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية. أشعل أنبوب الطرد المركزي من الأسفل لتصور شريط العاثية العكر في التدرج. ثم باستخدام قنية حادة ، قم بإزالة الجزء المحتوي على العاثية بعناية في أنبوب طرد مركزي فائق الفائق.

الآن ، أضف 30 مل من المخزن المؤقت TM البارد المثلج إلى الأنبوب وجهاز الطرد المركزي. ثم أعد تعليق الحبيبات في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت TM بعد التخلص من المادة الطافية. قم بتخزين العاثيات المعلقة في قارورة زجاجية عند أربع درجات مئوية طوال الليل.

أضف ميكروغرام واحد من البروتيناز K إلى العاثيات المعلقة. احتضن الخليط على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. ثم أضف حجما متساويا من كلوروفورم الفينول وخليط كحول الأيزوميل إلى العينة.

اقلبها لخلط جيدا وأجهزة طرد مركزي. انقل المرحلة المائية إلى أنبوب تفاعل جديد ، وكرر الاستخراج ثلاث مرات. قم بإجراء ثلاث عمليات استخراج خلفي من الكلوروفورم باستخدام حجم متساو من الكلوروفورم لإزالة الفينول المتبقي.

ثم ترسب الحمض النووي بإضافة 0.1 حجم من ثلاثة أسيتات الصوديوم المولية عند درجة الحموضة 5.5 ، و 2.5 حجما من الإيثانول. احتضن الخليط طوال الليل عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. في اليوم التالي ، قم بالطرد المركزي للعينة عند 15،000 جرام لمدة ساعة واحدة عند أربع درجات مئوية لحبيبات الحمض النووي.

اغسل حبيبات الحمض النووي مرتين ب 200 ميكرولتر من 70٪ إيثانول. هز الأنبوب وجهاز الطرد المركزي برفق مرة أخرى. قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

ثم resus ، تعليق الحمض النووي المنقى في ماء فائق النقاء. قم بتخزين الحمض النووي عند 20 درجة مئوية تحت الصفر حتى الاستخدام مرة أخرى. تلقيح خلايا الإشريكية القولونية BL 21D 3 التي يتم تحويلها باستخدام كل من بلازميد PET 28 NGTet ، وبلازميد تعبير CAS 12 أو CAS 9.

قم بزراعة المزرعة في وسط LB مع استكمال المضادات الحيوية المناسبة عند 37 درجة مئوية مع الاهتزاز. تحفيز تعبير NG TED عن طريق إضافة 0.05 ملليمولار IPTG ، واحتضان لمدة ساعتين إضافيتين عند 37 درجة مئوية. كعنصر تحكم ، قارن سلالات الإشريكية القولونية BL 21 D3 مع وبدون الإفراط في التعبير عن NgTET.

نقل 300 ميكرولتر من مزارع الإشريكية القولونية إلى أنبوب معقم. إصابة المزرعة إما بنوع T4 البري أو العاثيات المعالجة ب NgTET بتعدد العدوى بنسبة 0.01. تخلط برفق لضمان توزيع العاثيات بشكل متساو ثم احتضان مرة أخرى.

أضف خليط العاثية البكتيرية إلى أربعة ملليلتر من المثقاب الناعم LB الذي يحتوي على 0.75٪ مثقاب ومضادات حيوية. تخلط جيدا ولكن برفق لتجنب تكون الفقاعات. يسكب مزيج المثقاب الناعم على طبق مثقاب LB دافئ مسبقا.

دع الطبق يتجمد لفترة وجيزة في درجة حرارة الغرفة ويحتضن طوال الليل عند 37 درجة مئوية. في اليوم التالي ، عد اللويحات لتحديد عدد وحدات تشكيل اللويحات. لاختيار العداد ، قم بإصابة فاصل الإشريكية القولونية المصبوب 13 أمبير باستخدام العاثيات المراد تحديدها بشكل عداد.

قم بإجراء اختيار العداد في نفس الظروف المستخدمة للطفرات. بعد الحضانة ، قم بتصفية مادة SUP من خلال مرشح 0.45 ميكرومتر لإزالة الحطام البكتيري. استخدم العاثيات المختارة والمفلترة للعداد لمقايسة البلاك على سلالة الإشريكية القولونية B لعزل اللويحات الفردية للتحقق من صحة المصب.

كان شريط العاثية مرئيا بوضوح عندما كانت عينة العاثية T4 مركزة بشكل كاف. تم تأكيد التعبير عن بروتين NgTET في الإشريكية القولونية بواسطة عاثية SDS التي تظهر وجودها في كل من الكسور القابلة للذوبان وغير القابلة للذوبان بعد تحلل الخلايا والطرد المركزي. أظهرت الكروماتوغرامات أن الوفرة النسبية لديوكسيادينوزين وثنائي يودوهيدروكسي كينولين وثيميدين لم تتغير بين النوع البري والحمض النووي للعاثيات T4 المعالج ب NgTET.

تم تقليل وفرة مشتقات السيتوزين المعدلة بشكل كبير في الحمض النووي للعاثيات المعالجة ب NgTET مقارنة بالعينة غير المعالجة. تم بناء بلازميد يحتوي على جين NgTET ، ومناطق التماثل للطفرات المستهدفة باستخدام استنساخ البوابة الذهبية. أكد فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل نجاحا في تضخيم الفرس الجيني المستهدف في الممرات من الثاني إلى التسعة من الهلام الزراعي ، مما يشير إلى حدوث ضربات إيجابية بين اللويحات المختارة.

في الحمض النووي للعاثية من النوع البري T4 ، كانت الوفرة النسبية ل 5 جليكوزيل هيدروكسي إيثيل 2 ديوكسيدين رئيسي عالية. في الحمض النووي للعاثيات T4 المعالجة ب NgTET ، انخفضت مستويات 5 جليكوزيل هيدروكسي إيثيل 2 ديوكسيدين رئيسي بشكل كبير مقارنة بالنوع البري. احتفظ الحمض النووي للعاثية T4 المعالج بالطفرة التحفيزية غير النشطة NgTET D234 A بمستويات عالية من 5 جليكولهيدروكسي إيثيل 2 ديوكسيدين رئيسي.

أظهر ذرية العاثيات T 4 المستردة مستويات مستعادة تقريبا من 5 هيدروكسي ميثيل 2 ديوكسيدين رئيسي مقارنة بالنوع البري.