تقييم استجابات الأوراق للمستقلبات الثانوية الميكروبية باستخدام تنسيق عالي الإنتاجية

مختبري يعمل على تفاعلات الميكروبات النباتية بهدف نهائي هو تحسين مقاومة محاصيل الفقمات باستخدام الجينات. أظهرت التطورات الحديثة أن للمستقلبات الثانوية الميكروبية دورا رئيسيا في تعزيز حساسية النبات أو مقاومته. للبدء، استخدم فتحة فلين بقطر أربعة مليمترات لجمع ثلاثة أقراص أوراق لكل نبات، مع تجنب الوريد الأوسط.

مع الطرف الحاد، قم بحركة التواء لمنع نقع النسيج. أضف المستقلبات الثانوية أو معالجات المذيبات بالتركيز المطلوب إلى آبار فردية من صفيحة تضم 96 بئرا للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 200 ميكرولتر. ضع أقراص الأوراق برفق في الآبار.

ضع لوحة ال 96 بئر مع إزالة الغطاء في جرة جرس مزودة بفوهة تفريغ. ثم قم بتوصيل خرطوم التفريغ بفوهة جرس الجرة وشغل ضغط التفريغ عند 9.8 رطل لكل بوصة مربعة لمدة 10 ثوان. أطفئ المكدس وحرر الضغط ببطء خلال 10 ثوان، ثم كرر دورة التفريغ.

الآن ضع الغطاء مرة أخرى على لوحة 96 بئر وحضنها على هزاز مداري تحت مصدر ضوء. وضعه على بعد 23 سنتيمترا فوق الهزاز لمدة أربع ساعات. اغسل المجس بماء فائق النقي وامسح عليه برفق بمنديل خال من الوبر ليجف.

لاحظ قراءة التوصيل للماء للرجوع إليها مستقبلا. بين أربع إلى ست ساعات بعد العلاج، قم بقياس وتسجيل التوصيل في الآبار الفردية عن طريق غمر المجس في السائل المحيط بقرص الورقة. ثبت اللوح بزاوية 45 درجة لضمان غمر المجس بالكامل.

بعد الشطف، يتم عرض المجس في وقت مبكر، وأحيانا اختبار توصيلية الماء للتأكد من استقرار المجس. ثم ضع طبقة سقف بلاستيكية فوق لوحة ال 96 بئر وأعدها إلى الهزاز المداري للحضانة طوال الليل. لتحضير ركيزة البيروكسيداز، سخن 40 ملليلتر من الماء المعقم المقطر إلى درجة حرارة 70 درجة مئوية في كأس مع قضيب تحريك.

قم بإذابة 50 ملليغرام من خمسة حمض أميني ساليسيليك في ماء ساخن. ثم أضف ماء إضافيا ليصل الحجم الكلي إلى 50 ملليلتر واضبط الرقم الهيدروجيني إلى ستة باستخدام هيدروكسيد الصوديوم. احم المحلول الحساس للضوء بتغطية الحاوية بورق الألمنيوم.

في أنبوب مخروطي كهرماني بسعة 50 ملليلتر، حضر محلول بيروكسيد 1٪ في ماء فائق النقي. ثم أضف 10 ميكرولتر من محلول بيروكسيد الهيدروجين 1٪ لكل ملليلتر من خمسة محلول أميني من حمض الساليسيليك المطلوب لتوليد وسط الاختبار. عند النقطة الزمنية المطلوبة، اخلط خمس مرات، ثم انقل 50 ميكرولتر من كل بئر في لوحة العينة إلى صفيحة جديدة.

أضف 50 ميكرولتر من وسط الفحص وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق. لإيقاف التفاعل، أضف 20 ميكرولتر من هيدروكسيد الصوديوم العادي إلى كل بئر، واستخدم قارئ الألواح لقياس امتصاص كل بئر عند 595 نانومتر. أنتج الماء و0.1٪ ثنائي ميثيل كبريتسيد مستويات مشابهة من تسرب الأيونات ونشاط بيروكسيداز، مما يؤكد استخدامها كعوامل ضيبية.

أدى العلاج ب FLG 22 الميكرومولاري واحد إلى تسرب أيونات ونشاط بيروكسيداز وإنتاج الكالوز، مما أكد أنه كضابط إيجابي قوي. أدى علاج الجراميلين إلى تسرب أيوني كبير وإنتاج كالوز، لكنه كان له تأثيرات متغيرة على نشاط البيروكسيداز. تسبب السورباكتين عند 10 ميكرومولات في نشاط كل من البيروكسيداز وإنتاج الكالوز بينما ظل تسرب الأيونات دون تغيير.

علاج سم T-2 يقلل من نشاط البيروكسيداز، بينما يحفز إنتاج الكالوز ولا يؤثر على تسرب الأيونات. يتيح اختبار الهيدروليكروم لدينا للباحثين أخذ عينات من ثلاث استجابات إجهاد مختلفة في نفس العينة، مما يمكن الباحثين من الاستفادة القصوى من كميات محدودة من المستقلبات الثانوية الميكروبية. تتيح القدرة على مقارنة 96 عينة في نفس اللوحة للباحثين إجراء فحوصات على مستوى علم الوراثة السكاني، أو علم الأحياء النظامي لفهم تفاعلات الميكروبات النباتية.

سيستمر بحثي في التركيز على تفاعلات الميكروبات النباتية وتوصيف جينات النباتات التي يمكننا الاستفادة منها لتطوير مقاومة الأمراض في محاصيل الحبوب.