قياس شيخوخة الخلية الواحدة باستخدام مؤشر حيوي قائم على التصوير للكروماتين والشيخوخة فوق الجينية

طورنا الكروماتين المعتمد على التصوير وصورة العمر فوق الجيني الوراثي، وهي تقنية جديدة تهدف إلى قياس التقدم في السن والتجديد بدقة خلية واحدة. تقدر ساعات مثيلة الحمض النووي العمر البيولوجي، لكنها تعتمد على الانحدار الخطي، وتحتاج إلى مجموعات كبيرة، وتدمر العينات، مما يجعلها مكلفة وغير مناسبة للدراسات واسعة النطاق أو طولية. للبدء، انقل الأعضاء والأنسجة المجمدة إلى هاون مبرد مسبقا موضوع فوق الثلج الجاف.

صب النيتروجين السائل فوق الأنسجة المجمدة وطحنها جيدا باستخدام مدقة مبردة مسبقا حتى تحصل على مسحوق ناعم وموحد. باستخدام ملعقة معدنية مبردة مسبقا، قم بتقسيم الأنسجة المطحونة إلى عدة أنابيب. بعد استخراج النوى، اخلطها مع تريبان بلو بنسبة متساوية في أنبوب منفصل.

انقل 10 ميكرولتر من الخليط إلى جهاز قياس الدم، أو حملها في عداد خلوي آلي. أدخل وتحقق من جميع البيانات الوصفية، بما في ذلك معرفات العينة، والحالات، والمؤشرات الحيوية في خريطة اللوحة وصدر ملف CSV. الآن، قم بتوزيع 10,000 نواة لكل بئر في حجم 20 إلى 30 ميكرولتر في صفيحة بئر 384.

قم بجهاز الطرد المركزي على اللوحة عند 1000 جرام، مع ضبط التسارع على التاسع والتباطؤ على أربعة، لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، ثبت النوى بإضافة حجم متساو من 8٪ بارافورمالديهايد وPBS، وحضانه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة المثبت، أضف 30 ميكرولتر من 0.1 مولة جليسين في PBS وحضن لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة.

أزل محلول الجليسين واغسل الآبار مرتين ب 100 ميكرولتر من PBS. قم بإزالة PBS من كل بئر وأضف 30 ميكرولتر من محلول الانسداد الذي يحتوي على 2٪ BSA و0.5٪ Triton X-100 في PBS. حضن الطبق لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة.

بعد إزالة محلول المانع، حضن العينة ب 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية عند درجة حرارة أربع درجات مئوية. بعد ذلك، اغسل الآبار ثلاث مرات باستخدام 100 ميكرولتر من PBS، وكل غسلة تستغرق ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أضف 25 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي وحضنه لمدة ساعتين عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

ثم اغسل الآبار ثلاث مرات بسعة 100 ميكرولتر من PBS، وكل غسلة تستغرق ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. صبغ النوى ب DAPI أو Hoechst بإضافة 30 ميكرولتر من الصبغة بتركيز 0.01 ملليغرام لكل ملليلتر، واغسل الطبق مرة واحدة ب 100 ميكرولتر من PBS لإزالة الصبغة الزائدة. قم بتنزيل سكريبتات سير العمل من مستودع GitHub.

بمجرد اكتمال التحميل، قم بفك ضغط الملف لاستخراج محتوياته. نظم مستودع الصور المستنسخة بحيث يتطابق هيكل المجلدات مع التنسيق الذي يفترض في سير العمل لتنفيذ السكريبت بشكل صحيح. ثم افتح تطبيق الطرفية إذا كان يعمل على لينكس أو ماك أو إس إس، أو تطبيق WSL إذا كنت تستخدم ويندوز.

غير الدليل العامل إلى مجلد المستودع المستنسخ عن طريق كتابة الأمر المطلوب في الطرفية والضغط على Enter. أنشئ بيئة حسابية جديدة باسم Image_workflow باستخدام Conda مع Python الإصدار 3.10 واضغط على Enter. فعل بيئة Conda الجديدة باستخدام الأمر conda activate Image_workflow.

قم بتثبيت Poetry، وهو مدير حزم بلغة بايثون، داخل البيئة المفعلة باستخدام مثبت PIP. ثم قم بتثبيت جميع حزم بايثون المطلوبة لسير العمل باستخدام Poetry. الآن، قم بتكوين CUDA داخل بيئة Conda لتمكين وظائف وحدة معالجة الرسومات أثناء خطوة التقسيم.

افتح تطبيق الطرفية وغير المجلد إلى النسخة المستنسخة. تفعيل بيئة كوندا عن طريق كتابة الأمر أدناه والضغط على إنتر. افتح ملف سير العمل الرئيسي في محرر كود أو نصوص مثل VS Code أو Notepad لتكوين معلمات التحليل.

حدد اسم المشروع عن طريق تعيين المتغير p إلى معرف آمن قصير لنظام الملفات يستخدم لتنظيم المخرجات. قم بتعيين قائمة القنوات لاستخراج الميزات في chs، بما في ذلك قناة التقسيم إذا كانت الميزات من تلك القناة مطلوبة. باستخدام ImageIndex وتسمية القناة كمفتاح للاتصال، قم بتعيين معرف قناة الصورة من أسماء الملفات إلى رأس عمود خريطة اللوحة الحساسة للحروف التي تم حفظها سابقا.

ثم قم بتعيين مواقع البيانات عن طريق تعيين orgDataLoadPath لمسار مجموعة البيانات، وorgDataSubfolder إلى مجلد الصورة الفرعي إذا لزم الأمر، وresultsSavePath لمسار الإخراج. أكد امتداد اسم الملف في imageFileFormat. ثم قم بتحرير imageFileRegEx لاستخدام مجموعات التقاط تحمل اسم بايثون للأجزاء المطلوبة، بما في ذلك الصف، العمود، الحقل، موقع Z، والقناة.

الآن، قم بتعيين قناة التقسيم في segmentation_ch إلى القناة النووية المستخدمة لاكتشاف الأجسام. قرر ما إذا كان يجب استخدام تصحيح الإضاءة عن طريق ضبط تصحيح illumiCorrection وضبطه على true لحساب وتطبيق النماذج الأساسية. ثم ضبط حجم الفوكسل الفيزيائي بالميكرومتر في voxel_dim ك ZYX باستخدام بيانات وصفية المجهر.

احفظ الملف وأغلق المحرر بعد التحقق من كل معاملة. وأخيرا، شغل سكريبت سير العمل للحصول على قراءات الصور وإجراء التحقق، مع إبقاء الطرفية مفتوحة أثناء تشغيل السكريبت. تصور النتائج وتصدير قراءات الصور الخام لمزيد من التحليل في برامج خارجية.

أظهرت الصور الممثلة للخلايا الجذعية متعددة القدرات المستحثة نوى منفصلة بوضوح ملونة ب DAPI، وهيستون H3 ثلاثي الميثيل عند الليسين 27، والهيستون H3 الأسيتيلية عند الليسين 27. كشف تحليل الصور للعضلات الهيكلية والكبد عن فرق كبير بين العينات الصغيرة والقديمة، حيث أظهرت فئران OSKM القديمة صورة أقل مقارنة بالقديمة، مما يشير إلى إعادة برمجة جزئية. أظهر تحليل الفردية أن بعض عينات OSKM القديمة أظهرت قيم صور أقل بشكل ملحوظ مقارنة بالفئران القديمة.

يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة التغيرات المرتبطة بالعمر في الكروماتين والتنظيم فوق الجيني بدقة خلية واحدة عبر أنواع خلايا وأنسجة مختلفة. طريقتنا القائمة على التصوير غير مدمرة، تحافظ على بنية الكروماتين، وتسمح بتكرار القياسات، وهي أكثر فعالية من حيث التكلفة في الدراسات واسعة النطاق أو الطولية. ستركز الأبحاث المستقبلية على إضافة المزيد من العلامات فوق الجينية ودراسة البنى داخل النواة المرتبطة بالشيخوخة.