RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

Peter N. Huynh; Michael P. Vu; Catherine Cheng

doi:10.3791/69079

عزل الحمض النووي الريبي من ظهارة عدسة العين للماوس والكتل السائبة لخلايا الألياف

JoVE Journal
Biology

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

JoVE Journal Biology

RNA Isolation from Mouse Ocular Lens Epithelium and Fiber Cell Bulk Masses

عزل الحمض النووي الريبي من ظهارة عدسة العين للماوس والكتل السائبة لخلايا الألياف

Full Text

443 Views

06:07 min

October 10, 2025

DOI: 10.3791/69079-v

Peter N. Huynh¹, Michael P. Vu¹, Catherine Cheng¹

¹School of Optometry and Vision Science Program,Indiana University

Please note that some of the translations on this page are AI generated. Click here for the English version.

Overview

This study investigates the separation of mouse lens epithelial cells and fiber cells to analyze their distinct transcriptomes. By employing a novel protocol for RNA isolation, the research reveals significant differences in gene expression between the two lens cell types, shedding light on their unique biological processes.

Key Study Components

Research Area

Cellular biology of the mouse lens
Transcriptomic analysis of lens epithelial and fiber cells
Age-related lens pathologies

Background

The lens is composed of epithelial and fiber cells with different functions.
Transcriptomic studies have been hindered by difficulties in RNA isolation from lens cell types.
Understanding these differences can inform research on lens maintenance and pathologies.

Methods Used

Microdissection of lens from mouse eyes
RNA isolation using TRIzol and centrifugation techniques
Quantitative PCR analysis of isolated RNA

Main Results

Distinct gene expression profiles identified between epithelial and fiber cells.
Gja1 (connexin 43) showed high expression in epithelial cells, while Gja3 (connexin 46) was more prevalent in fiber cells.
Pax6 was strongly expressed in epithelial cells, indicating a potential regulatory role.

Conclusions

The study demonstrates a reliable method for separating lens cell types for transcriptomic analysis.
Findings contribute to understanding cellular differences that may lead to lens-related diseases.

Frequently Asked Questions

What are the key cell types in the mouse lens?

The main cell types are epithelial cells and fiber cells, each with distinct functions and gene expression profiles.

Why is RNA isolation important in this research?

Isolating RNA allows for the study of gene expression differences between the two cell types, which is crucial for understanding lens biology.

What technique was used to analyze RNA?

Quantitative PCR (qPCR) was used to assess gene expression levels in the isolated RNA samples.

How did the researchers separate the cell types?

They utilized microdissection techniques to cleanly separate the epithelial cells attached to the lens capsule from the fiber bulk mass.

What implications does this research have?

It aids in understanding age-related lens pathologies and potentially informs therapeutic approaches.

What genes were notably expressed in the different cell types?

Gja1 was primarily expressed in epithelial cells, while Gja3 was predominantly found in fiber cells.

How does this study advance our knowledge in biology?

It enhances our understanding of cellular differentiation and specific disruptions associated with lens pathologies.

يوضح هذا البروتوكول بالتفصيل فصل ظهارة عدسة عين الفأر وكتلة الخلايا الليفية ، متبوعا بعزل الحمض النووي الريبي وتحليل qPCR. تسمح هذه الطريقة بفصل مقصورات خلايا العدسة لتحليل أكثر تفصيلا للنسخ والعمليات البيولوجية في الخلايا الظهارية مقابل خلايا الألياف المتمايزة.

يركز بحثنا على العدسة ، وهي نسيج شفاف متخصص في الغرفة الأمامية للعين. تتكون العدسة من نوعين من الخلايا ، الخلايا الظهارية والخلايا الليفية التي لها وظائف مختلفة ونسخ متنوعة. هناك صعوبات في استخراج تركيز كاف من الحمض النووي الريبي من الخلايا الظهارية في الطبقة الأحادية للعدسة ، مما أعاق دراسة النسخ في الخلية الظهارية مقابل الخلية الليفية.

تسمح القدرة على فصل أنواع الخلايا الرئيسية للعدسة بشكل نظيف بتحقيق أعمق لصيانة العدسة وعدم تنظيمها. يتيح ذلك توصيف الاضطرابات الخاصة بنوع الخلية التي تؤدي إلى أمراض العدسة المرتبطة بالعمر. للبدء ، قم بتشريح العدسة من عيون الفأر المأخوذة حديثا من القتل الرحيم.

قم بلف العدسة برفق على مناديل نظيفة وحساسة باستخدام ملقط منحني لإزالة أي نسيج عدسي إضافي ملتصق متبقي. باستخدام ملقط مستقيم ناعم ، اخترق كبسولة العدسة بشكل ضحل بالقرب من خط الاستواء ، ثم قشر كبسولة العدسة برفق بعيدا عن كتلة الألياف السائبة ، تاركا الخلايا الظهارية للعدسة متصلة بالكبسولة. قم بإزالة أي قطع ألياف كبيرة من الكبسولة قد تكون قد خرجت أثناء إزالة الكبسولة.

الآن أمسك الكبسولة برفق بملقط مستقيم ناعم وقم بتدويرها في PBS لإزاحة أي ألياف متبقية. ماصة 400 ميكرولتر من كاشف TRIzol البارد في أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل لكل عينة. قم بإيداع كبسولتين من العدسة أو كتلتين من الألياف السائبة في كل أنبوب معني.

قم بتغطية الأنابيب بإحكام. قم بتجانس الكتل السائبة لألياف العدسة برفق في الأنابيب باستخدام مدقة بلاستيكية نظيفة ، ثم احتضنها. في غطاء الدخان ، أضف 200 ميكرولتر من الكلوروفورم لكل 400 ميكرولتر من كاشف TRIzol في كل أنبوب.

أغلق الأنابيب بإحكام ورجها بقوة باليد لمدة 15 ثانية ، مع إبقاء الإبهام في الجزء السفلي من الأنبوب والسبابة على الغطاء. بعد احتضان العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة للسماح بفصل الطور ، قم بالطرد المركزي للعينات عند 14،000 جم لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في غطاء الدخان ، انقل بعناية المرحلة المائية العلوية الشفافة إلى أنبوب طرد مركزي صغير نظيف سعة 1.5 مل ولاحظ الحجم.

ثم أضف 200 إيثانول إثبات إلى المرحلة المائية بنسبة حجمية واحد إلى واحد. الآن ، امزج المحلول برفق عن طريق قلب الأنبوب عدة مرات. انقل المحلول المختلط إلى عمود دوران الحمض النووي الريبي باستخدام ماصة.

قم بالطرد المركزي لأعمدة الدوران عند 16 ، 000 جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من التدفق من خلال الماصة 400 ميكرولتر من المخزن المؤقت لإعداد الحمض النووي الريبي إلى عمود الدوران. بعد طرد الأعمدة مرة أخرى ، تخلص من التدفق.

أضف 700 ميكرولتر من مخزن غسيل الحمض النووي الريبي إلى عمود الدوران. بمجرد اكتمال الغسيل النهائي والتخلص من التدفق ، قم بالطرد المركزي مرة أخرى عند 16,000 جم لمدة 30 ثانية عند أربع درجات مئوية لضمان جفاف عمود الدوران. انقل عمود الدوران المجفف إلى أنبوب طرد مركزي صغير جديد ونظيف ومسمى 1.5 مل.

ثم قم بسحب 15 ميكرولتر من الماء الخالي من RNase مباشرة على مرشح الغشاء واحتضان لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. قم بالطرد المركزي لعمود الدوران مرة أخيرة عند 16،000 جرام لمدة 30 ثانية عند أربع درجات سلزية لإزالة الحمض النووي الريبي المنقى. الآن قم بإزالة وتجاهل أعمدة الدوران.

سيكون الحمض النووي الريبي المنقى موجودا في السائل الذي تم جمعه في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة. احتضان عينات الحمض النووي الريبي عند 55 إلى 65 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لتعزيز الذوبان. ضع العينات على الفور على الثلج بعد خطوة التسخين.

قم بتخزين العينات عند 80 درجة مئوية تحت الصفر. لوحظت تعبيرات جينية تفاضلية بين الظهارة المعزولة والكتلة السائبة للخلايا الليفية. تم التعبير عن الجين Gja1 ، المعروف أيضا باسم connexin 43 ، بشكل أساسي في الخلايا الظهارية.

في المقابل ، كان للجين Gja3 ، الذي يشفر connexin 46 ، تعبير أعلى في خلايا الألياف. تم التعبير عن Gja8 ، أو connexin 50 ، في كل من الخلايا الظهارية والألياف. كان التعبير عن Cdh1 المشفر E-cadherin مرتفعا في الخلايا الظهارية بينما تم اكتشاف التعبير عن Cdh2 ، الذي يشفر N-cadherin ، في كل من الخلايا الظهارية والخلايا الليفية.

تم إثراء تعبير Pax6 بقوة في الخلايا الظهارية وكان غائبا تقريبا في الخلايا الليفية. في المقابل ، أظهر جين Crygs الذي يشفر بروتين جاما S البلوري تعبيرا مرتفعا للغاية في الخلايا الليفية مقارنة بالخلايا الظهارية.

View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos