في المختبر تمايز الخلايا التائية في ذاكرة CD8 المقيمة باستخدام نظام الزراعة المشتركة لخلايا العضو الظهاري العضوي التائي

يبحث بحثنا في خلايا الذاكرة المقيمة في CD8 في الجهاز التناسلي الأنثوي، ويفحص كيف تؤثر العدوى والأمراض على إقامتها ووظيفتها وصيانتها وإمكاناتها العلاجية. تحد الطرق الحالية من بقاء الخلايا التائية في الذاكرة المقيمة والاستقرار الظاهري. يتيح هذا البروتوكول دراسة مقابلة للتوسع في المختبر من خلال تحفيز إقامة الأنسجة من خلال زراعة خلايا T العضوية الصلبة.

للبدء، قم بعمل العضويات الظهارية المهبلية أو VEOs بكثافة 10,000 خلية في 20 ميكرولتر من مستخلص الغشاء القاعدي لكل بئر من صفيحة تحتوي على 24 بئرا. ضع الطبق في الحاضنة وحافظ على الثقافات لمدة سبعة إلى عشرة أيام عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. قبل يوم واحد من الزراعة المشتركة، استنشق وسائط زراعة الخلايا من الآبار المخصصة وغسل الآبار باستخدام DPBS.

استنشق DPBS، ثم أطلق 600 ميكرولتر من EDTA المسخن مسبقا بنسبة 0.25٪ تريبسين في البئر. باستخدام ماصة P1000 مغطاة ب BSA، أعد تعليقها جيدا لتعطيل مستخلص الغشاء القاعدي ميكانيكيا ونقل محتويات البئر إلى أنبوب مخروطي معقم مطليا ب BSA بسعة 15 ملليتر. الآن ضع الأنبوب المخروطي في حمام ماء بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

بعد خمس دقائق، أضف 10 ملليلتر من 10٪ FBS في RPMI لتبريد التريبسين. ثم ضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وادور على حرارة 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية وتخلص من السوبرناتانت. باستخدام رأس ماصة مغطاة ب BSA، أعد تعليق الحبيبة في 100 إلى 300 ميكرولتر من وسط زراعة الخلايا العضوية T أو DMEMF 12 العادي.

عد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم الخلفي. احسب حجم الفيروس المطلوب لتحقيق تعددية عدوى بقيمة 0.1 باستخدام إجمالي عدد الخلايا والعداد الفيروسي المعروف. استنشق وسط زراعة الخلايا من آبار VEO المختارة للإصابة.

اغسل كل بئر بسعة 500 ميكرولتر من DPBS المسخن مسبقا وضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. بعد خمس دقائق، تخلص من DPBS. أضف 500 ميكرولتر من الوسائط العضوية التي تحتوي على كمية كافية من الجسيمات الفيروسية لتحقيق تعددية العدوى بنسبة 0.1.

ضع الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة، مع تدوير الطبق بلطف يدويا كل 20 إلى 30 دقيقة. انقل الكمية المناسبة من مستخلص الغشاء القاعدي المطلوبة للطلاء من تخزين ناقص 80 درجة مئوية إلى أربع درجات مئوية واتركه يذوب لمدة ثماني ساعات. افحص VEOs تحت المجهر الضوئي لتقييم الحجم والصحة العامة.

تأكد من أن VEOs قطرها حوالي 100 ميكرومتر مع شكل دائري منتظم وخلايا منفردة قليلة. استنشاق وسائط زراعة الخلايا من آبار VEO وغسل كل بئر ب 500 ميكرولتر من DPBS المعقمة الباردة مع الحفاظ على درجة حرارة تتراوح بين درجتين إلى ثماني درجات مئوية. بعد إزالة DPBS، أضف من 200 إلى 500 ميكرولتر من محلول الحصاد العضوي البارد إلى كل بئر، لضمان حجم لا يقل عن 10 أضعاف نسبة إلى قطرة مستخلص الغشاء القاعدي.

ثم باستخدام ماصة P200 مغطاة ب BSA، قم بتعطيل مستخلص الغشاء القاعدي بشكل ميكانيكي. الآن ضع اللوحة على هزاز مداري مضبوط على حوالي 100 دورة في الدقيقة عند أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة. بعد الحضانة، استخدم رأس ماصة مطلية ب BSA لخلط ونقل محتويات كل بئر إلى أنبوب مخروطي معقم مطليا ب BSA بسعة 15 ملليلتر.

ضع الأنبوب في جهاز الطرد المركزي وادور بحرارة 500 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم تخلص من السوبرناتانت. اغسل حبيبة VEO بخمسة إلى عشرة ملليتر من DPBS البارد ثم قم بتحويلها إلى طرد مركزي مرة أخرى عند 500 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

استنشق DPBS، ثم باستخدام طرف ماصة P1000، وأعد تعليق الحبيبة في مليليتر واحد من وسط زراعة الخلايا العضوية T، وضع تعليق VEO على الثلج حتى تصبح الخلايا T جاهزة للزراعة المشتركة. لجمع خلايا T، تحقق من خلايا T الراكدة تحت المجهر الضوئي لتقييم الحجم والصحة العامة. تأكد من أن الخلية التائية تظهر بعض التجمعات، وتضخم الشكل، ولا توجد حطام أو شظايا خلوية مرئية.

باستخدام ماصة P1000، أعد تعليق خلايا T عن طريق التوصيل بأنابيب صعودا وهبوطا عدة مرات في كل زاوية من البئر. اجمع أنبوبا مخروطيا وعد إجمالي عدد خلايا T الحية في CD8. بعد ذلك، ضع تعليق الخلية T في جهاز الطرد المركزي وادور عند 584 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

تخلص من المادة الفائقة، وأعد تعليق حبيبة الخلية T في 10 ملليلتر من وسط زراعة الخلايا العضوية T. ثم نقل العدد المناسب من خلايا T إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على VEOs المعدة مسبقا لدمج الخلايا. ضع نظام تعليق VEO وT المشترك في جهاز الطرد المركزي ودوران مرة أخرى عند 584 جيلون لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد التخلص من الفائق، أعد تعليق VEOs وخلايا T في الحجم المناسب من مستخلص الغشاء القاعدي. ثم باستخدام رأس ماصة آخر، قم بتغليف التعليق على لوحة زراعة الأنسجة المسخنة مسبقا، مع صرف 20 ميكرولتر لكل بئر لتكوين صفيحة بسعة 24 بئر. الآن اقلب لوحة زراعة الأنسجة وضعها مقلوبة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية.

اترك 30 دقيقة للتصاق وتصلب مستخلص الغشاء القاعدي بالكامل. بعد فترة الحضانة، أضف بعناية وسط زراعة الخلايا التائية العضوية الكامل المدعم إلى كل بئر. وزع 500 ميكرولتر لكل بئر للوحة بها 24 بئر أو 250 ميكرولتر لكل بئر للوحة بسعة 96 بئر، مع إضافة الوسط إلى جانب البئر لتجنب إزعاج قطرة مستخلص الغشاء القاعدي.

استبدل وسط الزراعة كل يومين حتى يتم جمع العينات لتحليل قياس تدفق التومترية. أظهرت فئران تبلغ من العمر سبعة أيام موصولة بفيروس التهاب المشيمية السحايا اللمفاوي الذي يعبر عن بروتين فلوري أصفر تكرارا كبيرا للفيروس في وقت مبكر يصل إلى أربع ساعات من الزراعة المشتركة، وكانت الإشارات الفلورية داخل الأعضاء العضوية. أصبح تراكم خلايا T من CD8 بالقرب من الأعضاء المصابة بارزا في فترات زمنية لاحقة أثناء الزراعة المشتركة.

ارتبط التجمع التدريجي لخلايا CD8 T بتناقص واضح في إشارة البروتين الأصفر الفلوري في الأعضاء المصابة في نقاط زمنية لاحقة. أظهرت خلايا T في CD8 التي تم زراعتها معا مع VEOs المصابين زيادة في التعبير عن CD69 وCD 103 مع مرور الوقت، مما يشير إلى اكتساب نمط ذاكرة مقيم في الأنسجة. أظهرت الخلايا التائية المحفزة بالمستضدات زيادة كبيرة في إنتاج الإنترفيرون غاما والإنترلوكين 2 داخل الخلايا مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المحفزة.

يتيح هذا البروتوكول دراسة مخبرية لخلايا الذاكرة المقيمة في CD8، مما يسمح بالتلاعب الفعال بالخلايا الطهارية والخلايا التائية دون الاعتماد على نماذج حيوانية. التحدي الأهم في هذا البروتوكول هو الحفاظ على خلايا T الصحية والقابلة للحياة والخلايا الظهارية المهبلية، حيث أن ضعف القدرة على الحياة أو العدوى يؤثر على بقاء الزراعة المشتركة ونتائج التجارب. ركزنا على تحليل تدفق الخلايا الخلوي، لكن يمكن جمع الزراعة المشتركة للتلوين والتصوير والتسلسل.

الوسائط الآمنة تتيح ELISA في المراحل النهائية.