تحضير ومعالجة الشريان المتكلس مع مورفولوجيا محفوظة وRNA للتحليل المكاني الرقمي

يوفر علم النسخ المكاني ميزة على كل من تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية والمقياس الضخم للحمض النووي الريبي من خلال الحفاظ على المعلومات المكانية داخل الأنسجة. باستخدام أدوات مثل RNAscope، وفك الالتفاف الحاسوبي، ومجموعات بيانات خلية واحدة متاحة للجمهور، يمكن ربط سلوك الخلية بمخصوصاته وملفات جينية وبناء رؤية متكاملة لبيولوجيا الأنسجة. هذه التكنولوجيا تنفجر.

تركز ورقتان بحثيتان في مايو 2025 من مجلة Nature على دراسات الترانسكريبتوميكس المكانية. إذا قمنا برسم خريطة لمجلة PubMed، فإن المنحنى أكثر حدة: حوالي 150 ورقة بحثية في 2023، وما يقرب من 300 في 2024، وعلى وشك تجاوز 500 منشور في 2025. لقد أعادت علم النسخ المكاني تشكيل عدة مجالات بحثية رئيسية، مثل علم الأحياء السرطاني، وعلوم الأعصاب، وعلم المناعة، وعلم الأحياء التطوري.

ومع ذلك، فإن علم الأحياء الوعائي متأخر. تجعل التباين والهندسة الفريدة للشرايين والأوردة من حيث التصاق الأنسجة والحفاظ على الحمض النووي الريبي صعبا. بالإضافة إلى ذلك، تتميز الآفات الوعائية المتقدمة بالتكلس والجلطة، مما يقلل من سلامة الأنسجة بشكل أكبر.

تم تصميم هذا البروتوكول خصيصا للهياكل الشبيهة بالوعاء. ندرج أيضا منهجيات لتقليل التكلفة وعمليات التلوين اللازمة لتقييم الحمض النووي الريبي، وترسيب الكالسيوم، والخلايا ذات الاهتمام. نظرا لندرة الدراسات النسبية المكانية التي تركز على الأوعية الدموية مقارنة بالمجالات الأخرى، تم تصميم هذا البروتوكول ليكون فعالا من حيث التكلفة وسهل المبتدئين، حيث يوفر للباحثين في الأوعية الدموية أدوات متاحة لاعتماد علم النسخ المكاني في دراساتهم.

هذا البروتوكول قد يكون مفيدا أيضا لعينات المجموعات الكبيرة للتجارب السريرية. في هذا البروتوكول، نسصف إجراءات مفصلة تشمل التعامل الدقيق مع أنسجة الشرايين المتكلسة، وطرق تكلس الخصائص التي تهدف إلى الحفاظ على جودة الحمض النووي الريبي وشكل الأنسجة، وتقنيات التلوين للتحقق والتوجيه أثناء اختيار العائد على الاستثمار، والتلوين النهائي للعلامات الشكلية على الشرائح المحضرة، لضمان جاهزتها للمعالجة على أداة التحليل المكاني الرقمي. تم جمع الشرايين الظنبوبية البشرية، بما في ذلك الشرايين الأمامية للظنبوب والظنبوب الخلفية والعجان، من عينات بتر المرضى وتخزينها في DMEM تحتوي على 1٪ HEPES و1٪ Pen-Strep.

يتم نقل كل شريان إلى طبق بتري بقطر 100 ملم مع الوسط. يتم إزالة النسيج الضام المحيط بالأوعية الدموية الزائد باستخدام مقص ومقطط معقم، ليبقى فقط جدار الشريان. يتم نقل الشريان المقذوف إلى طبق بتري جديد.

يتم تجهيز لوح تقطيع معقم داخل الطبق. يتم قطع الشرايين إلى مقاطع بقطر سنتيمتر واحد باستخدام شفرة جراحية. يتم تجميد جزئين من كل شريان في أنابيب تجميد داخل النيتروجين السائل للحفاظ على التبريد والتخزين لأعمال البروتين أو الحمض النووي الريبي المستقبلية.

توضع الأجزاء المتبقية في أنابيب بسعة 15 مليليتر تحتوي على الفورمالين المحايد 10٪ ومثبتة عند أربع درجات مئوية لمدة 24 إلى 48 ساعة. يتم تحضير محلول إزالة الكالسية مع 10٪ EDTA في محلول مثبت RNA، مع تعديل الرقم الهيدروجيني إلى 5.2 للمحلول العامل. تنقل الأنسجة المثبتة إلى طبق جديد يحتوي على PBS، وتغسل الأنسجة لفترة وجيزة.

يتم نقل كل عينة إلى أنبوب بسعة 15 مليليتر يحتوي على محلول إزالة الكالسية وتحريك عند أربع درجات مئوية لمدة 72 ساعة. بعد الانتهاء من إزالة الكالسية، تغسل العينات مرتين باستخدام PBS مع تحريك خفيف لمدة خمس دقائق. يتم نقل المناديل إلى أشرطة كاسيت.

توضع الأشرطة في معالج الأنسجة. يتم إجراء معالجة الفورمالين لمدة لا تقل عن أربع ساعات. يمكن تغيير الوقت حسب مصفوفة العينة.

يتم وضع عدة مقاطع شريان في كل كتلة من القطاع. الكتلة تملأ بالبارافين وتترك لتبرد تماما. يتم إعداد الشرائح عن طريق وضع علامة على منطقة الأنسجة المقيدة على ظهر الشرائح.

تأكد من أن جميع المقاطع تقع ضمن المنطقة المحظورة المطلوبة بواسطة أداة DSP GeoMx. يتم تقليم البارافين الزائد من الكتل. ثم يتم تقسيم الكتل إلى خمسة ميكرون بشفرات منخفضة الارتفاع.

يتم تثبيت أشرطة المناديل داخل المنطقة المحددة. يتم تركيب أربعة أقسام تسلسلية على الأقل لكل كتلة للصبغات المختلفة في تجربة DSP. خزن الشرائح عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام.

بعد ذلك، يتم إجراء التهجين الميداني باستخدام RNAscope بالإضافة إلى التلوين النسيجي على شرائح معدة تسلسلية. بالإضافة إلى ذلك، يتم صبغ مجموعة أخرى من الشرائح بعلامات شكلية، مثل CD45 لخلايا المناعة وalpha-SMA لخلايا العضلات الملساء. يتكون إجراء التهجين الميداني بنظام RNAscope بشكل موجز من أربع خطوات رئيسية: خبز الشريحة كمعالجة مسبقة، إزالة البارافين وإعادة الترطيب القياسية، استرجاع الهدف، تهجين المجس مع تضخيم الإشارة، وتلوين الصبغة لرؤية الحمض النووي الريبي.

للتحقق النسيجي، يتم إجراء كل من تلوين H&E وتلوين Alizarin Red S للسماح بتحديد مواقع دقيقة لترسبات الكالسيوم. أخيرا، يتم إجراء تلوين العلامات الشكلية باستخدام بروتوكول الكيمياء المناعية النسيجية القياسية لتحديد الخلايا المعنية، موجها اختيار العائد على الاستثمار. في هذه الدراسة، تمت مقارنة بروتوكوليكين مبنيين على EDTA: الأول، 10٪ EDTA وحده لمدة 72 ساعة، والثاني، 10٪ EDTA ومحلول مثبت RNA لنفس المدة.

تم تقييم الشكل وجودة الحمض النووي الريبي بواسطة التهجين الميداني باستخدام RNAscope. حافظت كلتا الطريقتين على بنية الأوعية، لكن الشرائح التي عولجت بمزيج EDTA ومحلول تثبيت RNA أظهرت إشارات RNA أقوى بكثير، كما هو موضح في اللوحة اليمنى، مما يشير إلى أن محلول تثبيت RNA يحمي النسخ بينما يقوم EDTA بتصلب فوسفات الكالسيوم البلوري ويلين العينة تدريجيا دون تنشيط النازات. مع تحسين استراتيجية حفظ الحمض النووي الريبي وتأكيد الجودة، نعرض خطوات التلوين النسيجي لترسيب الكالسيوم باستخدام الهيماتوكسيلين والإيوزين وأليزارين الأحمر S. يرتبط أليزارين بشكل انتقائي بأملاح الكالسيوم الأيونية ويتحول لونها من البرتقالي إلى الأحمر الطوبي، مما يبرز بحساسية التكلسات الدقيقة والكبيرة، رغم أنه يوفر تفاصيل أقل في المصفوفة الخلوية وخارج الخلية مقارنة ب H&E.

استخدام كلا الصبغتين يعظم المعلومات الهيكلية والتركيبية. بعد تلوين العلامات الشكلية (مورفولوج) على العلامات، يتم مسح الشرائح على منصة GeoMx. الجسم المضاد CD45 يحدد خلايا المناعة، بينما يحدد أكتين العضلة الملساء ألفا خلايا العضلات الملساء الوعائية الوفيرة في الوسط.

تشمل العائد على المؤشرات المختارة حوالي 100 إلى 150 نواة ذات عائد RNA كاف. تم وضع العائد على المؤشرات بجوار المناطق المتكلسة وبعيدة عنها لمقارنة أنماط التعبير الجيني المكانية ذات الصلة بتكلس الشريان الظنبوبي الإنسي. على الرغم من فقدان بعض الأنسجة خلال خطوات المعالجة التي استمرت عدة ساعات، تم تحديد عدة عائد على المؤشرات المناسبة في كل جزء من الشريان.

في الختام، يغطي هذا السير عملية معالجة أنسجة الشريان المتكلسة وإزالة الكالسية من خلال التلوين المعتمد واختيار العائد على الاستثمار لدراسة النسخات المكانية. على وجه الخصوص، يضمن دمج H&E مع صبغة أليزارين الخاصة بالكالسيوم تحديد موقع دقيق للتكلس الوعائي ويعظم المعلومات الهيكلية والتركيبية لوضع العائد على العائد. تظهر تحليلات منظار RNAأن المقاطع الشريانية منزيعة الكالسية لا تزال سليمة إلى حد كبير مع وجود كمية كافية من RNA.