نموذج فأر حديثي الولادة لالتهاب الأمعاء والقولون الناخر وعزل الصفيحة الاحترافية لتنميط الخلايا المناعية

تركز أبحاثنا على المرض الذي يصيب الرضع الضعفاء الطبيين المعروف بالتهاب الأمعاء الناخر. نهدف إلى كشف الآليات المشاركة في الاستجابة المناعية في NEC وتطوير استراتيجيات للتشخيص المبكر والوقاية من المرض. من الصعب جدا دراسة استجابات خلايا المناعة المعوية لدى NEC لحديثي الولادة. يملأ بروتوكولنا هذه الفجوة من خلال إظهار كيفية عزل خلايا المناعة الصفيحية لتحليلها عبر قياس تدفق السيارة.

للبدء، احصل على مزرعة من البكتيريا المعوية التي تم زراعتها من رضيع يعاني من التهاب الأمعاء الكلي الناخر (NEC). في اليوم التجريبي 0 الساعة 3:00 مساء، قم بعمل ماصة بسعة 20 ميكرولتر من الثقافة في أنبوب زراعة سعة 15 ملليتر يحتوي على 2 ملليلتر من مرق لوريا-بيرتاني. حضن الزراعة البكتيرية عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 16 ساعة في هزاز مداري مضبوط على 1G، مع ضمان بقاء غطاء الأنبوب في وضع التهوية.

في الوقت نفسه، حضن أنبوب زراعة ثان يحتوي فقط على 2 ملليلتر من مرق لوريا-بيرتاني كوسيلة تحكم للتحقق من وجود أي تلوث. في اليوم التالي الساعة 7:00 صباحا، قذف 125 ميكرولتر من الزراعة البكتيرية الليلية في قارورة زراعة خلايا T75 ذات غطاء مهوى يحتوي على 25 ملليلتر من مرق لوريا-بيرتاني. جهز أربع قوارير T75 واحتضن في وضع قائم عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين في هتزاز مداري مضبوط على 1G.

في الساعة 9:00 صباحا في الأيام التجريبية 1 و2 و3، امزج 16 ملليتر من حليب الأطفال مع 8 ملليتر من حليب الجرو في أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 50 ملليتر لتحضير خليط الحليب الصناعي. إزالة المادة الفائقة من أنبوبين طرد مركزي بسعة 50 ملليلتر يحتويان على الزراعة البكتيرية الحبيبية. أعد تعليق كل من الحبيبتين بشكل جيد في 2 ملليلتر من خليط الحليب الجاهزة.

ثم نقل كلا الخليطين المعلقين إلى خليط الحليب المتبقي لإنتاج إجمالي 24 ملليلتر من تركيبة NEC. ضع علامة على ستة أنابيب طرد مركزي بسعة 50 مليلتر مع ست نقاط زمن للتغذية. بيبت 4 ملليلتر من تركيبة NEC في كل من الأنابيب الستة الموسومة.

بعد ذلك، جهز ستة أليكوات أحادية الاستخدام من مخزون الدهون البولي ساكاريد بجرعة 5 ملليغرام لكل ملليلتر وتخزينها في أنابيب دقيقة منخفضة الارتباط عند 20 درجة مئوية. قبل التغذية مباشرة، قم بإذابة واحدة من أليكوت ودوامة الدهن والسكريات لمدة 15 ثانية. أضف حجما محسوبا من عداد السكريات الدهنية إلى أنبوب تركيبة NEC سعة 4 ملليلتر وامزج جيدا عن طريق التقطيع.

املأ حقنة بسعة 1 ملليلتر بتركيبة NEC المحضرة واربطها بخط PICC لحديثي الولادة. لإعطاء تركيبة NEC لكل جرو عبر التممشيط الفموي، قم بتقييد الجرو بلطف من الجلد الفضفاض عند قاعدة الرقبة وامسكه بشكل مستقيم. مسافة إدخال خط PICC تساوي المسافة من زاوية الفم إلى أعلى بقعة الحليب في المعدة.

يجب وضع علامة على نقطة الإدخال المثلى على خط PICC باستخدام علامة دائمة. باستخدام الملقط، وجه خط PICC إلى البلعوم الفموي ثم إلى المعدة. إذا واجهت مقاومة، قم بإزالة خط PICC، وإعادة وضعه ومحاولة إعادة الإدخال.

قم بإعطاء 80 ميكرولتر من حليب NEC ببطء في المعدة. راقب الجرو بحثا عن علامات الشفط أثناء الرضاعة. بعد الرضاعة، أزل خط PICC وراقب الجرو لأي صعوبات في التنفس أو القيء.

إذا حدث ارتجاع، قم بمسح فم وأنف الجرو باستخدام مناديل مختبر منخفضة الوبر. كرر عملية التغذية في جميع أوقات التغذية. في اليوم التجريبي الرابع، احصل على نسيج الأمعاء من الفئران التي تم قتلها في حالة قتل رحيم.

باستخدام مقص، اقطع الأمعاء طوليا لفتحها، ثم قسمها عرضيا إلى مقاطع تتراوح بين 1-1.5 سنتيمتر. انقل أجزاء الأمعاء إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 15 ملليتر يحتوي على 10 ملليتر من محلول الهضم المسبق المبرد على الثلج. ثم حضن الأنبوب عند 37 درجة مئوية مع دوران مستمر لمدة 20 دقيقة لبدء تفكك الأنسجة.

قم بتدوير الأنبوب بلطف لإزالة الأنسجة المرتخية، ثم صب المحتويات عبر مصفاة خلايا بحجم 100 ميكرومتر موضوعة فوق أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليتر. انقل شظايا الأنسجة المتبقية إلى أنبوب طرد مركزي جديد بسعة 15 ملليتر يحتوي على 10 ملليتر من محلول الهضم المسخن مسبقا إلى 37 درجة مئوية. حضن العينة بدوران مستمر لمدة 40 دقيقة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية.

ثم انقل المحتويات إلى أنبوب تفكك الأنسجة الآلي. شغل البرنامج بأربع دورات دوران متناوبة باتجاه عقارب الساعة وعكسها مدة كل 15 ثانية. عند اكتمال التفكك، قم بتدوير تعليق الخلية بلطف في أنبوب التفكك ثم قم بطرد مركزه عند 300 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

استنشق السوبريتانت بعناية دون إزعاج الحبيبة. أعد تعليق الخلايا في 1 ملليلتر من محلول فرز الخلايا البارد النشط بالفلورة. ضع مصفاة خلية بحجم 100 ميكرومتر فوق أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليتر.

انقل الخلايا المعلقة عبر المصفاة واغسلها بسعة 2 ملليلتر من محلول فرز الخلايا المنشط بالفلورية الباردة. عد الخلايا المعزولة وقيم قابلية البقاء باستخدام صبغة ترابان بلو أو صبغة قابلية للحياة. قم بجهاز الطرد المركزي بحجم القياس الخلوي المطلوب للتدفق الخلوي عند 300 جرام لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية.

لوحظ انخفاض كبير في البقاء على قيد الحياة في مجموعة العلاج NEC مقارنة بالمجموعة التي تم تغذيتها من السدود. أظهر الفحص الإجمالي للأمعاء لفئران NEC خصائص مميزة ل NEC، بما في ذلك علامات واضحة على الانتفاخ، وتجمع الهواء، والاسترواح المعوي مقارنة بالأشخاص الأصحاء الضابطين. كشفت تلوين الهيماتوكسيلين والإيوسين عن تدمير متقطع في الزغابات واضطراب في بنية الأمعاء في فئران NEC مقارنة بالزغب السليمة في الفئران الضابطة.

كان تعبير RNA رسول IL1B وCXCL2 وLCN2 أعلى بشكل ملحوظ في مجموعة NEC مقارنة بمجموعة السطرة. لم تكن خلايا المناعة الإجمالية CD45+ في صفيحة الأمعاء المجنونة مختلفة بشكل ملحوظ بين مجموعات NEC ومجموعة الضابطة. كانت مستويات البلعم مرتفعة بشكل ملحوظ في أمعاء NEC مقارنة بالمجموعة الضابطة.

أظهرت فئران NEC زيادة في نسبة الخلايا النخاعية، خصوصا الخلايا الأحادية والبلاعميات، مقارنة بأنواع المناعة الأخرى. تكشف طرق التنوع الأحادي الخلية عن توقيعات خلايا مناعية في NEC، مقدمة رؤى جديدة حول الآليات والمؤشرات الحيوية المحتملة. نمذجة NEC تحد لأن المرض متعدد العوامل.

يتطلب تكرار بيئة الأمعاء البشرية، والاستجابات المناعية، والتأثيرات الميكروبية في الفئران حديثة الولادة تحسينا دقيقا. يدمج نموذجنا الميكروبيوم المستخرج من الإنسان، ونقص الأكسجين، والتغذية بالحليب الصناعي، مما يجعله ذا صلة فسيولوجية ومتناسقا لتحليل الخلايا المناعية التفصيلية في الفئران حديثة الولادة.