تقييم ديناميكيات الانشطار / الاندماج في الخلايا الأنبوبية القريبة من الكلى

في مختبرنا نهدف إلى زرع الميتوكوندريا في الأعضاء المصاب لاستعادتها. لهذا السبب نطور بروتوكول عمليات جديد لعزل الميتوكوندريا الفعالة والنشطة ديناميكيا. تشمل التحديات تتبع الميتوكوندريا المزروعة دون تلوين، مع تقييم دقة لتكاملها ووظائفها وسلوكها الديناميكي مع الخلايا المتلقية الجديدة.

لبدء بذور الخلايا الأنبوبية القريبة من الكلى في ألواح زراعة قاع زجاجي. حضن الخلايا طوال الليل للسماح بالالتصاق والنمو. في اليوم التالي، أضف سيسبلاتين إلى الصفيحة التجريبية إلى تركيز نهائي من ضرسين ميكرو.

بعد ذلك، قم بتكوين ليزرات المجهر الكونفوكلي إلى 405 نانومتر، و488 نانومتر لإثارة Dendra2 غير المحولة، و561 نانومتر. شغل الليزر واترك حوالي 10 دقائق للتثبيت. ضع قرص الزراعة في غرفة الحضانة.

أضف الماء حول الحجرة واضبط درجة الحرارة إلى 37 درجة مئوية، لضمان الحفاظ على إمداد ثاني أكسيد الكربون. دع غرفة الحضانة تتوازن قبل التصوير. تصور الخلايا باستخدام تكبير ودقة أعلى لتصوير الميتوكوندريا.

افتح القائمة المنسدلة في الزاوية العلوية اليسرى واختر خيارات FRAP. باستخدام برنامج LAS X، حدد المنطقة التي ستجري فيها عملية التبييض الضوئي. الآن، طبق نبضة ليزر عالية الشدة لتبييض المنطقة المهتمة عن طريق ضبط ليزرات FRAP على 405 نانومتر عند 4.00، و488 نانومتر عند 0.00.

و561 نانومتر عند 0.00. اضبط ما قبل التبييض على 5.140 ثانية ل 59 تكرارا وحدد توقيت ما بعد التبييض. للتصوير بعد التبييض، استمر في التقاط الصور بكثافة ليزر منخفضة لمدة 10 دقائق باستخدام ليزرات FRAP عند 405 نانومتر عند 0.00، و488 نانومتر عند 0.50.

و561 نانومتر عند 0.50. لتحليل الميتوكوندريا المدمجة بين الأخضر والأحمر، قم أولا بتثبيت إضافة RGB. افتح برنامج ImageJ، ثم من قائمة الملفات حدد موقع وافتح ملف الصورة لتحليله.

اختر وضع الألوان المركب، ثم اختر خيار التدرج التلقائي وافتح الفيديو أو الصورة للتحليل. ارسم منطقة مستطيلة فوق الصورة وانقر بزر الفأرة الأيمن لاختيار تكرار. اختر خيار تكرار التكديس الكبير لتكرار جميع مجموعات الصور.

اختر الصورة واختر RGB في قائمة الصورة المنسدلة لتحويل المكدس المكرر إلى صيغة RGB. قم بنسخ صورة RGB واختر إطارا واحدا فقط. إذا بدت الميتوكوندريا منحنية، ارسم خطا على طولها، ثم اذهب إلى قائمة التعديل، اختر الاختيار واضغط على استقامة.

الآن، اختر عنوانا للصورة الموحدة واضبط عرض الخط إلى 20 بكسل. ارسم خطا على طول الميتوكوندريا المستقيم لمحاذاة الشريط بشكل صحيح. وافتح إضافة RGB Profiler.

بمجرد تفعيلها، ستولد الإضافة مخططا يوضح شدة الفلورة الحمراء والخضراء على طول الخط المرسوم. ارتفاع كل قمة سيكون متناسبا طرديا مع شدة الفلورة. بعد الاندماج، تأكد من أن الفلورة الحمراء انتشرت إلى الميتوكوندريا الخضراء المجاورة، مما يدل على اختلاط المحتوى.

تحقق من أن مخطط الشدة يظهر الآن قمم حمراء وخضراء متداخلة. لتقييم الاندماج، اختر الميتوكوندريا الصحية والميتوكوندريا المبيضة ضوئيا للاندماج في تصوير الخلايا الحية. راقب التغير في نسبة الفلورة الحمراء إلى الخضراء مع مرور الوقت للدلالة على أحداث الاندماج.

أظهرت الخلايا الضابطة ميتوكوندريا ممدودة مع مصفوفة صفراء تشير إلى اندماج الميتوكوندريا بين المصفوفات الحمراء والخضراء. أظهرت الخلايا المعالجة بالسيسبلاتين ميتوكوندريا مجزأة مع تداخل أقل في الإشارات الحمراء والخضراء، مما يشير إلى ضعف في الاندماج. انخفض تعافي الفلورة في المنطقة المبيضة الضوئية مع مرور الوقت في الخلايا الضابطة، مما يشير إلى اندماج ميتوكوندريا نشط.

حافظت الخلايا المعالجة بالسيسبلاتين على نسبة فلورية شبه مستقرة تشير إلى ضعف اندماج الميتوكوندريا. انخفض تعبير CLRS-1 بشكل ملحوظ في الخلايا المعالجة بالسيسبلاتين مقارنة بالمجموعة الضابطة. استخدام تعبير الخلايا للفلورة والميتوكوندريا القابلة للتبديل الضوئي يساعدنا في تتبع الميتوكوندريا وتقييم ديناميكيتها في الخلايا المستقبلة.

يكشف قياس شكل الميتوكوندريا الحية عن صحة الخلايا في الوقت الحقيقي، ووضع العلامات الجينية، والبروتينات القابلة للتبديل الضوئي تعزز الدقة والمتانة. ستستكشف الأبحاث المستقبلية الآلات الخلوية، سواء الميتوكوندرية أو السيتوبلازمية، التي تنسق إعادة التشكيل لتشكيل الميتوكوندريا الأنبوبية أو الكروية أو الدائرية.