تصوير الخلايا الحية للنقل الداخلي باستخدام الأجسام النانوية الوظيفية في الخلايا المستزرعة

نحن ندرس حركة الارتقاع الخلوية والرجعية للبروتينات العابرة للغشاء بالإضافة إلى الآليات التي تمنح النقل. لدراسة حركة البروتينات من سطح الخلية، تستخدم عادة الأجسام المضادة التقليدية، لكنها قد تعزز الترابط المتقاطع واستهداف الليسوسوم. للبدء، احصل على حبيبة من بكتيريا الإشريكية القولونية المحولة باستخدام VHH-mCherry.

أضف 30 ملليلتر من محلول الارتباط البارد المثلج الذي يحتوي على 20 ملليمول إيميدازول في PBS إلى حبيبات الخلية البكتيرية. باستخدام الماصة، أعد تعليق الحبيبة جيدا عن طريق التوصيل بالماصات صعودا وهبوطا. انقل الخليط المعلق إلى أنبوب طرد مركزي بسعة 50 ملليلتر معنون.

أضف إلى الخلايا المعلقة 200 ميكروغرام لكل ملليلتر ليزوزيم، و20 ميكروغرام لكل ملليلتر DNase I، وكلوريد مغنيسيوم مليمولر واحد، وفلوريد فينيل ميثيل سلفونيل مليمولر واحد. بعد حضانة الأنبوب في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، وضعه على مدور من طرف إلى طرف واستمر في الحضانة عند أربع درجات مئوية لمدة ساعة. بعد ذلك، أدخل طرف مسبار صلب بطول ستة ملليمترات من جهاز السونيك مباشرة في نظام تعليق الخلية.

تعطيل الخلايا البكتيرية ميكانيكيا باستخدام ثلاث نبضات صوت مدتها دقيقة واحدة بسعة 40٪ ودورة عمل من ثانية تشغيل وثانية واحدة مطفأة. مما يسمح بفترة تبريد دقيقة واحدة بين كل نبضة. بعد الطرد المركزي، يتم الاحتفاظ بالليزات المصفى على الثلج أثناء التحضير لكروماتوغرافيا الألفة المعدنية الثابتة باستخدام أعمدة تنقية علامات معبأة مسبقا ومخصصة لمرة واحدة مصممة لتشغيل تدفق الجاذبية.

ثبت أعمدة حمض النيكل-نيتريلوترايسيتيك على حامل معدني أو حامل أعمدة مناسب. ثم أفرغ مخزن التخزين من العمود بالكامل. توازن العمود بإضافة 10 ملليلتر من محلول الارتباط الذي يحتوي على 20 ملليمولر إيميدازول في PBS.

اسمح للعازل بالمرور عبر الجاذبية. قم بتطبيق حوالي 30 ملليلتر من الليزات البكتيرية المنزاة تدريجيا على العمود المتساوي. دعها تمر بالجاذبية وتخلص من التدفق من خلالها.

ثم غسل العمود بتطبيق حجمين متتاليين بحجم 10 ملليلتر من محلول الربط الذي يحتوي على 20 ملليمولر إيميدازول في PBS. يتم إخراج الأجسام النانوية المرتبطة بتطبيق ملليترين من مخزن الفضول يحتوي على 500 ملي مول إيميدازول في PBS داخل أنبوب طرد مركزي دقيق مكون من ملليترين. قم بتسوية عمود إزالة الملح المزروع في محول أنبوب بسعة 50 ملليلتر عن طريق شطفه خمس مرات بخمسة مليليتر من PBS.

دع المخزن يدخل الراتنج المضغوط بالكامل، ثم تخلص من التدفق من خلاله. بعد الشطف الأخير، قم بطرد مركزي على العمود بقوة 1000 × g لمدة دقيقتين. الآن انقل العمود مع محوله إلى أنبوب جمع جديد بسعة 50 مليليتر بعد التخلص من التدفق من خلالها.

تحميل ملليلترين من الجسم النانوي الوظيفي المائل على عمود إزالة الأملاح المسبق. ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى عند 1000 x جرام لمدة دقيقتين لجمع الإليوات قبل التحقق من تعبير VHH-mCherry ونقائه. تشغيل برنامج نظام التصوير الحي الآلي.

انقل غرفة المجهر الإيبيدي إلى مرحلة المجهر. قم بإعداد قناتين تصوير باستخدام مرشحات الإثارة والانبعاث ل EGFP وmCherry. اختر وقت تعريض قصير وشدة إضاءة منخفضة لتجنب التبييض الضوئي.

حافظ على الإعداد ثابتا في جميع التجارب. قد تختلف الإعدادات بين الصحفيين. لكل شرط، يخزن إحداثيات 10 حقول رؤية مختلفة تحتوي على ثلاث إلى أربع خلايا في بؤرة التركيز في قائمة نقاط.

ثم التقط لقطة واحدة لكل موقع في قائمة النقاط لتكون صورة مرجعية قبل إضافة VHH-mCherry. لبدء الاندويتيزوس، أضف بلطف 350 ميكرولتر من محلول VHH-mCherry المسخن مسبقا إلى كل بئر مع تقليل الاضطراب في الطبقة الأحادية. ثم تابع في اكتساب الصور.

قم بالتقاط التايم لابس لمدة 100 إطار بفواصل 32 مع الحفاظ على 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون. لتحليل امتصاص VHH-mCherry الداخلي، قم بتحميل مجموعات الصور الزمنية في برنامج تحليل الصور. تطبيق أدوات التقسيم والتتبع لقياس الفلورة الداخلية المكثفة مع مرور الوقت عبر مناطق الاهتمام المختلفة.

تم تنقية جميع متغيرات الأجسام النانوية الوظيفية إلى إنتاجية عالية ونقائية، مع تدهور بسيط فقط في VHH-mCherry في البروتيولية. تم تأكيد نواتج التحلل ل VHH-mCherry كمجالات فردية من VHH-mCherry باستخدام اكتشاف نقطة مناعية محددة للحوات. في غياب BirA، تم استرداد VHH-mCherry بحوالي 20 ملليغرام لكل تحضير.

وتم تأكيد البيوتينيل من خلال سحب الستريبتافيدين أغاروز لخلطات BSA النانوية. أظهرت بروتينات الاندماج الموسومة ب EGFP المعبر عنها في خلايا HeLa أنماط توطين تحت الخلية متوافقة مع نظيراتها الداخلية، بما في ذلك التموقع المحيط بالنووي ل EGFP-CDMPR و EGFP-CIMPR. تحديد الموقع الحصري حول النواة ل EGFP-TGN46 وتحديد المواقع المحيطية ل TfR-EGFP.

مكن VHH-mCherry من تصور الخلايا الحية لنقل EGFP-CDMPR عبر الاندويس، مما أظهر زيادة في التداخل مع الموقع خلال 60 دقيقة. وصل امتصاص VHH-mCherry إلى خلايا تعبير EGFP-CDMPR إلى هضبة بعد حوالي 43 دقيقة، مع نصف عمر يبلغ تسع دقائق. في الخلايا التي تعبر عن TfR-EGFP، تراكم VHH-mCherry بسرعة بين الخلايا مع عمر نصف يبلغ أربع دقائق وتشبع بعد 20 دقيقة.

لقد أنشأنا مجموعة أدوات متعددة الاستخدامات قائمة على الأجسام النانوية لتحليل نقل أي بروتين عبر الغشاء من سطح الخلية. نستخدم الأجسام النانوية الفلورية لوضع علامات على بروتينات الشحن السطحي ثم ندرس تجاربها الداخلي بواسطة مجهر الخلايا الحية. من خلال نهجنا في تصوير الخلايا الحية القائم على الأجسام النانوية، نرغب في اكتشاف مسارات تدفع نقل البضائع من السطح إلى شبكة عبر جولجي.