November 21st, 2025
يقيس هذا البروتوكول بشكل كمي استقرار ونصف عمر الحمض النووي الريبي المعزز بين الجينات وداخل الوراثة في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران باستخدام علاج الأكتينومايسين D، وRT-qPCR، وتحليل الانحدار غير الخطي. يتم دمج استراتيجيات تطبيع خاصة بالموقع لنمذجة ديناميكيات تحلل eRNA بدقة بطريقة تعتمد على السياق.
يدرس مختبرنا علم التخلق فوق الجيني مع التركيز على تعديل الحمض النووي الريبي والمحسنات على المستوى الجزيئي. وجدنا مؤخرا أن إنزيم m5C في الحمض النووي الريبي Nsun2 ينظم بواسطة معزز داخل الجين في الخلايا الجذعية الجنينية للفئران. للبدء، قم بطلاء آبار صفيحة زراعة الخلايا ذات الست آبار مسبقا بمقدار ملليتر من الجيلاتين لكل بئر.
حضن الصحون على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. استنشق الجيلاتين من كل بئر، ثم اغسل كل بئر مرة واحدة بملليلتر واحد من PBS. قم بتعقيم الألواح بوضعها تحت ضوء فوق بنفسجي لمدة لا تقل عن 15 دقيقة.
الخلايا الجذعية الجنينية للفئران على الصفائح المغطاة بالجيلاتين باستخدام ملليلترين من وسط زراعة الخلايا الكامل في كل بئر. حضن الخلايا عند 37 درجة مئوية في حاضنة رطبة تحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون. بعد ذلك، إذابة أكتينوميسين D في ثنائي ميثيل سلفوكسيد لتحضير محلول مخزن بتركيز ملليغرام واحد لكل ملليلتر.
بعد يومين من زرع الخلايا أو في يوم الحصاد، أضف محلول مخزون أكتينومايسين D إلى وسط الزراعة. اجمع عينات عند 0، 5، 10، 15، 20، و30 دقيقة بعد العلاج. بعد توقف النسخ، انخفض تعبير RNA المعزز بسرعة خلال خمس دقائق بينما انخفض RNA الرسول بشكل تدريجي وبقي مستقرا نسبيا خلال 30 دقيقة. أظهرت تحليلات نصف العمر أن الحمض النووي الريبي المعزز أظهر نصف عمر يتراوح بين دقيقتين إلى ثلاث دقائق، بينما كان للحمض النووي الريبي الرسول عمر نصف عمر أطول بكثير، يتجاوز 60 دقيقة.
بالنسبة للحمض النووي الريبي المحسن بين الجينات Pou5f1، أدى التطبيع إلى RNA رسول TBP أو إلى قيمة عتبة الدورة عند صفر دقيقة إلى تقديرات نصف عمر مماثلة. أظهرت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي الناشئ ارتفاعا في قيم RPKM في منطقة معزز Nsun2 مقارنة بنقطة التحكم السلبية. أكد تحليل RT-qPCR وجود تعبير طبيعي أعلى للحمض النووي الريبي المحسن بين الجينين Nsun2 في منطقة معزز Nsun2 مقارنة بالتحكم السلبي.
طريقة التطبيع المستخدمة للمحسنات بين الجينات مناسبة لأن نمط التعبير بالنسبة للتحكم السلبي يتوافق مع النمط المرصود باستخدام RPKM. توفر دراستنا طريقة لقياس وتطبيع الخط القصير من المعززات المتدهورة بسرعة. نعالج نقص طريقة واضحة لمقارنة نشاط المعززات بين الجينات وداخل الجينات.
يبسط معالجة البيانات ويسمح بحساب سريع لتدهور mESC باستخدام خطوات واضحة ودقيقة.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
يقيس هذا البروتوكول بشكل كمي استقرار وعمر النصف لـ RNAs المعززات بين الجينات وداخل الجينات في الخلايا الجذعية الجنينية للفأر باستخدام معالجة الأكتينومايسين D، وRT-qPCR، وتحليل الانحدار غير الخطي. تم دمج استراتيجيات التطبيع الخاصة بالمواقع لنمذجة ديناميكيات تحلل eRNA بدقة بطريقة تعتمد على السياق.
Quantitative assessment of enhancer RNA (eRNA) stability in mouse embryonic stem cells addresses a critical gap in understanding transcriptional regulation dynamics during early discovery. Accurate measurement of eRNA decay kinetics enables mechanistic de-risking and informs target validation strategies for gene regulatory elements. This capability supports predictive confidence in modulating enhancer activity for therapeutic discovery pipelines.
This quantitative eRNA stability method integrates into the early discovery-to-lead identification continuum, supporting both hypothesis testing and downstream assay development.