الهندسة اللاجينية لخلايا K562: استراتيجية عرضية مزدوجة المتجه لمثيلة الحمض النووي المستهدفة المستقرة باستخدام بروتينات الاندماج dCas9-DNMT3A و -HDAC1

يهدف بحثنا إلى تطوير نظام مستقر وغير متكامل لميثلة الحمض النووي المستهدفة، مستكشفا التحرير اللاجيني الدائم في خلايا K562. تشمل التقدمات الحديثة في هذا المجال أنظمة CRISPR-dCas9 ذات التأثيرين المزدوجين، التي تجمع بين الإنزيمات اللاجينية لتعديل فوق جيني متآزر، مستقر، ومحلي محدد. للبدء، حافظ على خلايا K562 في قوارير زراعة T75 عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون وظروف رطبة.

قم بقياس الحمض النووي الإبيزومي المستخدم في النقل باستخدام مطياف فوتومتر عند 260 نانومتر. استخدم ثمانية ميكروغرامات من الحمض النووي الكلي للبلازميد في كل عملية نقل عن طريق تحضير أربعة ميكروغرامات من كل بلازميد لعملية نقل مشترك، وامزج الكمية المطلوبة مع 90 ميكرولتر من الماء فائق النقي. الآن، أضف 10 ميكرولترات من محلول أسيتات الصوديوم بسعة 3 أضراس و2.5 حجم من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى محلول الحمض النووي المخفف.

اخلط محلول الحمض النووي جيدا وحضنه طوال الليل عند درجة حرارة 20 درجة مئوية للسماح بترسيب الحمض النووي. في اليوم التالي، قم بجهاز الطرد المركزي لأنبوب ترسيب الحمض النووي عند حرارة 11,000 جرام لمدة 15 دقيقة عند أربع درجات مئوية. في ظروف معقمة في خزانة السلامة البيولوجية، تخلص بعناية من المادة الفائقة من الأنبوب.

أضف 500 ميكرولتر من 70٪ إيثانول إلى الأنبوب لغسل الحبيبة، ثم استخدم الطرد المركزي مرة أخرى على حرارة 11,000 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية. بعد ذلك، أزل مادة الإيثانول الفائقة تماما من الأنبوب، ودع حبيبات الحمض النووي تجف في الهواء حتى لا يبقى الإيثانول المرئي. ثم أعد تعليق حبيبات الحمض النووي المجففة جيدا في 50 ميكرولتر من DMEM.

احتفظ ب 400 نانوجرام من الحمض النووي المعلق حوالي 2.5 ميكرولتر في أنبوب جديد، وتخزين محلول DMEM البلازميدي عند أربع درجات مئوية حتى الاستخدام الآخر. شغل عينة الحمض النووي المتبقية على جل 1٪ أغاروز للتحقق من تنقية وسلامة الحمض النووي. احصد خلايا K562 من قارورة T75 عندما تصل الزراعة إلى 50 إلى 60٪ من التقاء المياه لضمان كفاءة النقل المثلى.

عد الخلايا المستخرجة باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي، وانقل حجما يحتوي على ضعف 10 إلى قوة خمس خلايا إلى طبق زراعة بحجم 35 ملم يحتوي على 900 ميكرولتر من DMEM بدون FBS أو مضادات حيوية. ضع طبق الزراعة في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون للحفاظ على الخلايا في حالة استعداد للنقل. استخدم مجموعة ترانسفيكشن تعتمد على الليبوفكتامين لتوصيل البلازميدات وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وضبط الحجم إذا لزم الأمر.

أضف ثلاثة ميكرولترات من مادة P3000 إلى محلول البلازميد DMEM المعد مسبقا. اخلط برفق، وحضن الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. الآن، أضف خمسة ميكرولترات من كاشف ليبوفكتامين 3000 مع كمية كافية من DMEM للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 100 ميكرولتر.

حضن هذا الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. أضف كامل 100 ميكرولتر من خليط النقل إلى طبق الزراعة بقطر 35 ملم الذي يحتوي على الخلايا. اهز الطبق بلطف لتوزع الخليط بشكل متساو، ثم أعده إلى الحاضنة.

بعد 24 ساعة من عملية النقل، أضف ثلاثة ملليلتر من DMEM المتوسط الكامل مع 10٪ FBS ومرة واحدة من البنسلين ستربتوميسين في كل طبق لتعزيز تكاثر الخلايا المنقولة. بعد 72 ساعة من عملية النقل، ابدأ الاختيار بإضافة مضاد حيوي G418 للوصول إلى تركيز نهائي يبلغ ملليغرام واحد لكل مليليتر. بمجرد أن يتم تحديد عملية الاختيار ويتجاوز إجمالي عدد الخلايا مرة واحدة في عشرة إلى قوة ستة، يتم جمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند حرارة 300 جرام لمدة ست دقائق عند درجة حرارة 25 درجة مئوية.

اغسل الحبيبة مرة واحدة باستخدام PBS معقم مرة واحدة، ودرجة الحموضة حوالي 7.4، ثم الطرد المركزي مرة أخرى تحت نفس الظروف. بعد إعادة تعليق الحبيبة النهائية في PBS مرة واحدة، حدد تركيز الخلية باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي. تخفيف التعليق إلى واحد في 10 إلى قوة ست خلايا لكل ملليلتر، لضمان إعادة تعليق الخلايا بالكامل، وانقل الخلايا إلى أنبوب قياس خلوي تدفق.

بعد ذلك، قم بإعداد جهاز فرز الخلايا المنشط بالفلورة على وضع خلية واحدة باستخدام لوحة معالجة بزراعة الأنسجة بسعة 96 بئر كجهاز جمع. قم بضبط إعدادات البرنامج حسب الآلة المستخدمة. قم بتهيئة السكان الأوليين باختيار الخلايا بناء على التشتت الأمامي والتشتت الجانبي لعزل الحجم المتوقع والحبيبية.

استبعد الحطام والخلايا الحبيبية الدقيقة أو الميتة، واستخدم مخططات منطقة التشتت الأمامية مقابل الارتفاع أو مساحة التشتت الجانبي مقابل الارتفاع لاستخدام مخططات السحب البوابة. ثم املأ كل بئر من الطبق المكون من 96 بئر بسعة 100 ميكرولتر من الوسط الكامل يحتوي على ملليغرام واحد لكل ملليلتر من G418، وسخن الطبق في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. قم بفرز الخلايا في وضع الخلية الفردية، مع الحفاظ على معدل الفرز أقل من 300 حدث في الثانية لتحسين الدقة.

بعد الفرز، افحص كل بئر تحت المجهر للتأكد من وجود خلية واحدة في كل بئر، ووضع اللوح في حاضنة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. اسمح للنسخ المفردة الخلية بالتوسع بشكل فردي في صفيحة 96 بئرا. بمجرد أن يظهر نمو النسخ، أضف وسط يحتوي على G418 مخفضة إلى الآبار إلى تركيز نهائي يبلغ 400 ميكروغرام لكل ملليلتر للحفاظ على ضغط الانتقائ.

نقل النسخ التي تنمو جيدا بشكل متسلسل إلى ألواح ذات 12 بئر، ثم إلى قوارير T25، وأخيرا إلى قوارير T75 حسب الحاجة حتى تصل كل نسخة إلى حوالي واحد في 10 إلى قوة ست خلايا. بعد ذلك، اجمع حبيبات الخلايا المزدوجة على فترات منتظمة. خزن حبيبة واحدة عند ناقص 20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الجيني.

توحيد حبيبة ثانية في 500 ميكرولتر من كاشف تريزول، وخزنها ناقص 20 درجة مئوية لاستخراج الحمض النووي الريبي وتخليق الحمض النووي المكمل. استخراج الحمض النووي الجينومي من نسخ مختارة باستخدام استخراج الفينول-كلوروفورم يليه ترسيب الإيثانول. أعد تعليق الحمض النووي المستخرج بالكامل في ماء خال من النوكلياز أو مخزن TE.

قس تركيز ونقاء الحمض النووي باستخدام مقياس طياف قبل الاستمرار في الخطوات التالية. وأخيرا، استخلاص إجمالي الحمض النووي الريبي من حبيبات الخلايا المخزنة باستخدام كاشف تريزول، يليه ترسيب الأيزوبروبانول. تم فرز الخلايا المفردة إلى صفائح بسعة 96 بئر باستخدام فرز الخلايا المنشطة بالفلورية لعزل الخلايا التي تحمل كلا التركيبين.

أكد تحليل PCR ل 10 نسخ موسعة أن بعضها فقط احتفظ بكلا التركيبين، كما أشير إلى نطاقات تحتوي على 230 زوج قاعدي و205 أزواج قاعدة. كشف التفريغ البيروزي أن النسخة الإيجابية الثانية أظهرت زيادة في المثيلة في عدة مواقع CPG بالقرب من منطقة هدف gRNA1 مقارنة بالمجموعة الضابطة غير المنقلة. نعالج نقص أنظمة التوصيل طويلة الأمد غير المتكاملة، مما يتيح التحرير اللاجيني الدقيق والمستقر دون تغيير جينوم المضيف.

تؤسس نتائجنا أداة موثوقة لدراسة تنظيم الجينات عبر المثيلة المستهدفة، وتدعم تطوير علاجات فوق جينية دقيقة محتملة. ستستكشف الأبحاث المستقبلية تحسين التوصيل العرضي، وتقليل التأثيرات المستهدفة، وتعزيز كفاءة Cas9، وتكييف النظام لتناسب النماذج الأولية أو الحية في الجسم.