تحديد مواقع مستقبلات أستيل كولين النيكوتين العصبية في الغشاء البلازما والخلايا الخلوية باستخدام التصوير الكمي في الخلايا الثديية

فهم تنقل مستقبلات الأستيل كولين النيكوتينية إلى أغشية البلازما في الثدييات أمر بالغ الأهمية لدراسة التنظيم الذي يعبر عنه المرافعون وتقييم العلاجات الانتقائية المستهدفة. ميزة رئيسية للمجسات الحساسة لدرجة الحموضة مع المجهر الكونفوكالي الحي للخلايا هي الدقة المكانية العالية لموقع الوحدات الفرعية. للبدء، المواد المسبق الساخنة إلى 37 درجة مئوية.

قم بإذابة وحدة nAChR DNase بالكامل وارفع كاشف النقل إلى درجة حرارة الغرفة. نظف جميع الكواشف بنسبة 70٪ إيثانول قبل وضعها داخل خزانة السلامة البيولوجية. للتعبير عن ألفا-7 nAChR، في أنبوب طرد مركزي دقيق، قم بتخفيف ألفا-7 وبلازميد NACHO DNase إلى وسط مصل مختزل.

اخلط بلطف عن طريق التوصيل بالماصات بعد إضافة الحمض النووي. بدلا من ذلك، للتعبير عن مستقبلات ألفا-4 بيتا-2، قم بتخفيف 4 ميكروغرامات من كل وحدة فرعية في الحمض النووي إلى ما مجموعه 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل وامزجه بلطف. قم بضبط نسب الوحدات الفرعية لتحسين التعبير عن أشكال المستقبلات المحددة.

بالنسبة لمستقبلات ألفا-4 بيتا-2 مع بلازميد إضافي، أضف كميات متساوية من حمض نووي كل بلازميد. بعد ذلك، في أنبوب طرد مركزي دقيق جديد، قم بتخفيف 8 ميكرولتر من مادة التحويل بشكل قطري إلى 250 ميكرولتر من وسط مصل مختزل. بعد حضانة لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ادمج DNase المخفف مع كاشف النقل المخفف بشكل قطري في أنبوب.

اخلط بلطف عن طريق استخدام الماصات واحتضن لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أثناء تكوين المجمعات، استبدل الوسط في أطباق الزراعة بسعة 1 ملليلتر من EMEM الخالي من المصل. أضف 500 ميكرولتر من مركب كاشف نقل الحمض النووي بشكل قطري إلى كل طبق.

اخلط بلطف عن طريق هز اللوحة لتوزيع الطبق بشكل متساو، خاصة على سطح الزجاج القاعي. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة واستبدل الوسط بعد 4-6 ساعات. أزل الوسط القديم عن طريق الشفط.

اشطف الطبق ثلاث مرات بملليتر من PBS لمدة 10 دقائق لكل منهما في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف 2 ملليلتر من مخزن التصوير pH 7.4 إلى الطبق. أدخل طبق التصوير في حامل الشريحة لميكروسكوب كونفوكال وضع الحامل في غرفة البيئة المسخنة مسبقا.

قم بتوصيل أنبوب المضخة البريستالية بحامل صحون التصوير وأغلق الغرفة البيئية. الآن، شغل برنامج التصوير واختر الليزرات للفلوروفورات المعنية. امسح الطبق لتحديد مكان الخلايا للتصوير باستخدام عدسة 10-60 x الموضوعية.

زد التكبير إذا رغبت، وضبط عمق التركيز حسب الحاجة. اختر الدقة المفضلة والتقط صورة واحدة باستخدام الهدف المطلوب. سجل الموقع على خريطة الطبق لإعادة توزيع نفس الخلايا بعد تغيير المخزن المؤقت.

كرر التصوير لعدة مناطق على الطبق باستخدام نفس إعدادات الالتقاط لجميع الصور. مع إبقاء خط المخرج متصلا فقط بمضخة التبيض، قم بشفط مخزن pH 7.4 ببطء من الطبق إلى حاوية نفايات. ثم نقل خط المدخل إلى مخزن التبريد pH 5.5.

شغل المضخة التهوية لإضافة عازل pH 5.5 بمعدل تدفق 1.5 ملليلتر في الدقيقة، مما يضمن بقاء الخلايا متصلة. بعد 20 دقيقة، أوقف المضخة وحضن الخلايا في المخزن لمدة 20 دقيقة إضافية للسماح بالتوازن. بعد الحضانة، أعد تصوير المواقع المحفوظة.

لبدء قياس الصورة، افتح ImageJ وحمل الصورة لتحليلها. ستظهر الصورة كمكدس مع عرض كل قناة تم التقاطها في نفس الإطار. انتقل إلى قناة الطور.

إذا بدت الصورة ساطعة بشكل مفرط، اختر عملية واختر تعزيز التباين ثم اضغط موافق. استخدم أداة العدسة المكبرة لتكبير خلية واحدة. استخدم أداة الاختيار الحر لتتبع مخطط الخلية في قناة الطور. ثم ينتقل إلى القناة الفلورية التي تتوافق مع الفلوروفور المعني.

حدد القياسات المطلوبة باختيار التحليل والنقر على تعيين القياسات. تأكد من فحص المساحة، القيمة الرمادية المتوسطة، والكثافة المتكاملة. لقياس المنطقة المحددة، اختر التحليل ثم اضغط على القياس.

خذ ثلاث قياسات خلفية عن طريق تتبع المناطق الفارغة بالقرب من الخلية المختارة. بعد إجراء القياسات لجميع الخلايا المطلوبة، قم بنسخ ولصق بيانات القياس في إكسل للتحليل. ثم احسب متوسط الخلفية من القياسات الثلاثة للخلفية.

احسب القيمة الكلية المصححة للفلورة أو CTCF لكل خلية باستخدام الصيغة المقدمة. باستخدام نفس سير العمل، قم بتحليل الصور التي تم الحصول عليها بعد تغيير المخزن المؤقت. تصدير جميع النتائج إلى برامج تحليل البيانات للمعالجة الإحصائية.

لوحظ تلوين ضعيف ب alpha-BTX AF647 في خلايا N2a غير المنقولة، بينما تم اكتشاف وسم ثقل قوي في الخلايا التي تم نقلها بحمض ألفا-7. أكد القياس أن تعبير غشاء البلازما ل nAChRs ألفا-7 كان أعلى بشكل ملحوظ في الخلايا التي تم نقلها N2a من ألفا-7 مقارنة بالأشخاص الذين لم يتم نقلهم للضبط. عند درجة الحموضة 7.4، كان الفلورة الكلية لألفا-7 pHuji مرئية عند غشاء البلازما.

في خلايا N2a المنقولة. عند pH 5.5، تم تقليل فلورة ألفا-7 pHuji، مما كشف عن تحديد موقع المستقبلات الداخلي. كان فلورة مستقبلات الفا-7 الخارجي تمثل غالبية تعبير المستقبلات.

أظهرت الكمية أن 82.6٪ من مستقبلات alpha-7 pHuji كانت تقع على غشاء البلازما، بينما 17.4٪ كانت داخلية. تم استعادة الفلورة عند العودة إلى درجة الحموضة 7.4، مما أكد قابلية انعكاس إشارة pHuji. عند pH 7.4، أظهرت خلايا N2a التي تعبر عن alpha-4 SEP وbeta-2 pHuji تألق غشائي قوي لكلا الوحدتين الفرعيتين.

عند درجة الحموضة 5.5، تم تبريد الفلورة، مما يشير إلى تمركز داخلي لبعض وحدات ألفا-4 SEP وبيتا-2 pHuji. أظهرت الكمية أن 76.5٪ من SEP ألفا-4 كان عند غشاء البلازما، و23.4٪ داخليا. في الخلايا التي تم نقلها ثلاثيا، أظهر SEP ألفا-4 82.8٪ توطين الغشاء و17.2٪ تعبيرا داخليا.

في نفس الخلايا، تم تحديد 63.4٪ من وحدات بيتا-2 pHuji على الغشاء بينما كانت 36.6٪ داخل الخلية. باستخدام البروتوكول المعروض، قمنا بتوصيف تأثيرات جديدة للمرافق على تعبير مستقبلات النيكوتين وتداولها، وقمنا بتقييم العلاجات الانتقائية المستهدفة الجديدة. ميزة بروتوكولنا هي القدرة على التكيف مع مستقبلات النيكوتين المتجانسة وغير المتجانسة، مما يمكن من قياس الموقع الخلوي النسبي.

يتيح نهجنا التعبير السريع والقوي لمستقبلات النيكوتين في غشاء بلازما النيكوتين، مما يساعد في تحليل الاتجار بوساطة المرافقة وجهود اكتشاف المخدرات.