توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا للفأر لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض

يركز هذا البحث على فهم كيفية إصابة مسببات الأمراض البكتيرية لظهارة البروستاتا، وأي التفاعلات الممرضة مع المضيفين تحدد نتيجة العدوى. النماذج الموجودة في المختبر لم تلتقط بشكل جيد تنوع ظهارة البروستاتا. يوفر هذا النموذج نظاما فسيولوجيا ذا صلة يعكس اختلاف أنواع الخلايا الموجودة في الأنسجة.

للبدء، احصل على عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد من الفئران التي تزرع على قطرات من المصفوفة خارج الخلية في صفيحة مكونة من 24 بئرا. استنشق الوسط من العدد المطلوب من الآبار وأضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة الطازج إلى كل بئر. باستخدام ماصة P 1000 يمكن تعطيل قطرات المصفوفة خارج الخلية في كل بئر بشكل ميكانيكي.

اجمع هذا التعليق في أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليلتر مع جمع لا يزيد عن بئرين في كل أنبوب. أضف وسط زراعة طازج لرفع الحجم إلى 10 مليليتر. اقلب الأنبوب بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلطه، ثم قم بعمل الطرد المركزي عند 450 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

استنشق السوبرناتان. أعد تعليق الحبيبة في محلول إنزيمي بجرعة مليلتر، ثم سخنها إلى 37 درجة مئوية، ثم حضن التعليق في حمام ماء عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. باستخدام ماصة P 1000، اخلط تعليق الخلية كل خمس دقائق أثناء الحضانة.

بعد الحضانة، أضف وسط زراعة طازج للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 10 ملليلتر. اقلب الأنبوب بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلطه. الطرد المركزي عند 450 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.

استنشق السوبرناتانت دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة بسعة 300 ميكرولتر مع إضافة 10 مثبط صخور ميكرومولر. باستخدام غرفة عد نيوباور، قم بعدد الخلايا في التعليق.

قم بتخفيف التعليق إلى تركيز 62,500 خلية لكل ملليلتر في وسط الزراعة مع إضافة مثبط صخري بحجم 10 ميكروموللار. ثم زرع 200 ميكرولتر من نظام التعليق لكل بئر لتكوين لوحة 48 بئر و300 ميكرولتر لكل بئر للسلايدات الصغيرة المجهزة. حضن الألواح في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد يوم واحد، تحقق مما إذا كانت معظم الخلايا المفردة قد التصقت بسطح الزراعة ثنائي الأبعاد. استبدل وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام واستمر في الزراعة حتى يتم التقاء النقطة خلال سبعة أيام. لتحفيز التمايز لإثراء الخلايا المضيئة، أضف 10 نانومولار من خمسة ألفا ديهيدروتستوستيرون أو DHT إلى تعليق الخلية أثناء البذر.

انشر سلالة الإشريكية القولونية الممرضة الممرضة (UPEC) على طبق LB Agar مدعوم ب 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. باستخدام حلقة معقمة، تم تلقيح ثلاثة ملليترات من مرق LB مع إضافة 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين مع مستعمرة بكتيرية واحدة.

حضن الثقافة بشكل ثابت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. دوامة الزراعة البكتيرية الليلية. قس الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر.

ثم احسب حجم الزراعة اللازمة لتحقيق كثافة بصرية ابتدائية تبلغ 0.05 في ثلاثة ملليلتر من المرق. أضف الحجم المحسوب من زراعة البكتيريا إلى مرق LB الطازج المكمل بالأمبيسيلين. حضن بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.

بعد الحضانة، تقوم بدوامة في زراعة البكتيريا. قس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. احسب حجم الزراعة اللازم لتحقيق كثافة بصرية مقدارها واحد.

قم بجهاز الطرد المركزي بحجم مطلوب عند 12,000 جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. استنشق وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في ملليتر واحد من بريموس ووسط زراعة العضوية الحر بدون DHT.

ثم تخفيف التعليق باستخدام وسط زراعة عضويات البروستاتا للفئران لتحقيق تعدد عدوى يصل إلى 100. اسحب وسيط الثقافة من النموذج القائم على الأورغانويد المحضر. أضف 200 ميكرولتر من وسط الزراعة الذي يحتوي على بكتيريا إلى كل بئر من صفيحة تحتوي على 48 بئرا.

حضن لمدة ساعة في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استنشق الوسط الموجود بالبكتيريا من الآبار وغسل الآبار ثلاث مرات بوسط زراعة طازج لإزالة البكتيريا خارج الخلية. بعد ذلك، أضف وسط الزراعة الذي يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من جنتامايسين وحضنه لمدة 30 دقيقة.

استنشق الوسيط. أضف وسط زراعة طازج، مع إضافة 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من جنتامايسين لبقية فترة العدوى. استخدم المجهر الكونفوكلي لتصوير الخلايا المصابة بعد التلوين الفلوري وقياس الخلايا المصابة باستخدام مقياس تدفق الخلوي.

في حالة السيطرة بدون ديهيدروتستوسترون، كانت معظم الخلايا سيتوكيراتين، خمسة خلايا قاعدية موجبة مع وجود عدد قليل فقط من التعبير الضوئي منخفض في CD 24 8. أدى تناول DHT نانومولر واحد إلى إنتاج مجموعات مختلطة من اللومينال القاعدي، رغم أن CD 24A بقي منخفضا. زيادة DHT إلى 10 نانوموللار عززت التمايز إلى الخلايا اللومائية، مع الحفاظ على بعض الخلايا القاعدية بعد سبعة أيام من الزراعة.

ارتبط ذلك بالدراسات التي أظهرت انخفاضا في الخلايا الأساسية الإيجابية لخمس سيتوكراتين وزيادة في الخلايا المضيئة الموجبة CD 24A مع زيادة تركيز DHT مع مرور الوقت. في الصفر ساعة بعد العدوى، التزمت UPEC بأعداد كبيرة بالخلايا الطهارية. بعد علاج الجينتامايسين لمدة ساعة واحدة، انخفض عدد الخلايا الموجبة لفيروس نقص المناعة البشرية بشكل حاد.

عند 24 ساعة، كانت أعداد الخلايا المصابة مشابهة لتلك التي كانت في ساعة واحدة. أظهر التصوير الكونفوكالي بعد 24 ساعة أن البكتيريا داخل الخلية استمرت في التكاثر لتكوين تجمعات شبيهة بالمجتمعات. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة ديناميكيات العدوى البكتيرية وتلك التفاعلات مع مسببات الأمراض في نموذج يحافظ على التنوع الخلوي الظلائي.

يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذا النموذج للتحقيق في أمراض البروستاتا المتنوعة، بما في ذلك العدوى، وبيولوجيا السرطان، واختبار المركبات العلاجية المحتملة.