توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا للفأر لدراسة التفاعلات بين المضيف والممرض
February 27th, 2026
يصف هذا البروتوكول توليد نموذج قائم على عضويات البروستاتا في الفأر ينمو في أبعاد ثنائية الأبعاد. يشمل ذلك التفكك العضوي، وزرع الخلايا، والتمايز، وتقييم سلامة الظهارة، والعدوى المجهزة في المختبر بالإشريكية القولونية الممرضة للبول. يوفر النموذج إمكانية الوصول إلى القمة ومناسب لدراسة تفاعلات المضيف مع الممرض، متغلبا على قيود الأنظمة العضوية ثلاثية الأبعاد التقليدية.
يركز هذا البحث على فهم كيفية إصابة مسببات الأمراض البكتيرية لظهارة البروستاتا، وأي التفاعلات الممرضة مع المضيفين تحدد نتيجة العدوى. النماذج الموجودة في المختبر لم تلتقط بشكل جيد تنوع ظهارة البروستاتا. يوفر هذا النموذج نظاما فسيولوجيا ذا صلة يعكس اختلاف أنواع الخلايا الموجودة في الأنسجة.
للبدء، احصل على عضويات البروستاتا ثلاثية الأبعاد من الفئران التي تزرع على قطرات من المصفوفة خارج الخلية في صفيحة مكونة من 24 بئرا. استنشق الوسط من العدد المطلوب من الآبار وأضف 500 ميكرولتر من وسط الزراعة الطازج إلى كل بئر. باستخدام ماصة P 1000 يمكن تعطيل قطرات المصفوفة خارج الخلية في كل بئر بشكل ميكانيكي.
اجمع هذا التعليق في أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليلتر مع جمع لا يزيد عن بئرين في كل أنبوب. أضف وسط زراعة طازج لرفع الحجم إلى 10 مليليتر. اقلب الأنبوب بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلطه، ثم قم بعمل الطرد المركزي عند 450 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
استنشق السوبرناتان. أعد تعليق الحبيبة في محلول إنزيمي بجرعة مليلتر، ثم سخنها إلى 37 درجة مئوية، ثم حضن التعليق في حمام ماء عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. باستخدام ماصة P 1000، اخلط تعليق الخلية كل خمس دقائق أثناء الحضانة.
بعد الحضانة، أضف وسط زراعة طازج للوصول إلى حجم نهائي يبلغ 10 ملليلتر. اقلب الأنبوب بلطف ثلاث إلى أربع مرات لخلطه. الطرد المركزي عند 450 جرام لمدة خمس دقائق عند أربع درجات مئوية.
استنشق السوبرناتانت دون إزعاج الحبيبات. أعد تعليق الحبيبة في وسط زراعة بسعة 300 ميكرولتر مع إضافة 10 مثبط صخور ميكرومولر. باستخدام غرفة عد نيوباور، قم بعدد الخلايا في التعليق.
قم بتخفيف التعليق إلى تركيز 62,500 خلية لكل ملليلتر في وسط الزراعة مع إضافة مثبط صخري بحجم 10 ميكروموللار. ثم زرع 200 ميكرولتر من نظام التعليق لكل بئر لتكوين لوحة 48 بئر و300 ميكرولتر لكل بئر للسلايدات الصغيرة المجهزة. حضن الألواح في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد يوم واحد، تحقق مما إذا كانت معظم الخلايا المفردة قد التصقت بسطح الزراعة ثنائي الأبعاد. استبدل وسيط الزراعة كل يومين إلى ثلاثة أيام واستمر في الزراعة حتى يتم التقاء النقطة خلال سبعة أيام. لتحفيز التمايز لإثراء الخلايا المضيئة، أضف 10 نانومولار من خمسة ألفا ديهيدروتستوستيرون أو DHT إلى تعليق الخلية أثناء البذر.
انشر سلالة الإشريكية القولونية الممرضة الممرضة (UPEC) على طبق LB Agar مدعوم ب 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين. حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 16 إلى 24 ساعة. باستخدام حلقة معقمة، تم تلقيح ثلاثة ملليترات من مرق LB مع إضافة 100 ميكروغرام لكل ملليلتر أمبيسيلين مع مستعمرة بكتيرية واحدة.
حضن الثقافة بشكل ثابت عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. دوامة الزراعة البكتيرية الليلية. قس الكثافة البصرية للثقافة عند 600 نانومتر.
ثم احسب حجم الزراعة اللازمة لتحقيق كثافة بصرية ابتدائية تبلغ 0.05 في ثلاثة ملليلتر من المرق. أضف الحجم المحسوب من زراعة البكتيريا إلى مرق LB الطازج المكمل بالأمبيسيلين. حضن بشكل ثابت عند 37 درجة مئوية لمدة 24 ساعة.
بعد الحضانة، تقوم بدوامة في زراعة البكتيريا. قس الكثافة البصرية عند 600 نانومتر. احسب حجم الزراعة اللازم لتحقيق كثافة بصرية مقدارها واحد.
قم بجهاز الطرد المركزي بحجم مطلوب عند 12,000 جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. استنشق وتخلص من السوبرناتانت. أعد تعليق الحبيبات البكتيرية في ملليتر واحد من بريموس ووسط زراعة العضوية الحر بدون DHT.
ثم تخفيف التعليق باستخدام وسط زراعة عضويات البروستاتا للفئران لتحقيق تعدد عدوى يصل إلى 100. اسحب وسيط الثقافة من النموذج القائم على الأورغانويد المحضر. أضف 200 ميكرولتر من وسط الزراعة الذي يحتوي على بكتيريا إلى كل بئر من صفيحة تحتوي على 48 بئرا.
حضن لمدة ساعة في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. استنشق الوسط الموجود بالبكتيريا من الآبار وغسل الآبار ثلاث مرات بوسط زراعة طازج لإزالة البكتيريا خارج الخلية. بعد ذلك، أضف وسط الزراعة الذي يحتوي على 50 ميكروغرام لكل ملليلتر من جنتامايسين وحضنه لمدة 30 دقيقة.
استنشق الوسيط. أضف وسط زراعة طازج، مع إضافة 10 ميكروغرام لكل ملليلتر من جنتامايسين لبقية فترة العدوى. استخدم المجهر الكونفوكلي لتصوير الخلايا المصابة بعد التلوين الفلوري وقياس الخلايا المصابة باستخدام مقياس تدفق الخلوي.
في حالة السيطرة بدون ديهيدروتستوسترون، كانت معظم الخلايا سيتوكيراتين، خمسة خلايا قاعدية موجبة مع وجود عدد قليل فقط من التعبير الضوئي منخفض في CD 24 8. أدى تناول DHT نانومولر واحد إلى إنتاج مجموعات مختلطة من اللومينال القاعدي، رغم أن CD 24A بقي منخفضا. زيادة DHT إلى 10 نانوموللار عززت التمايز إلى الخلايا اللومائية، مع الحفاظ على بعض الخلايا القاعدية بعد سبعة أيام من الزراعة.
ارتبط ذلك بالدراسات التي أظهرت انخفاضا في الخلايا الأساسية الإيجابية لخمس سيتوكراتين وزيادة في الخلايا المضيئة الموجبة CD 24A مع زيادة تركيز DHT مع مرور الوقت. في الصفر ساعة بعد العدوى، التزمت UPEC بأعداد كبيرة بالخلايا الطهارية. بعد علاج الجينتامايسين لمدة ساعة واحدة، انخفض عدد الخلايا الموجبة لفيروس نقص المناعة البشرية بشكل حاد.
عند 24 ساعة، كانت أعداد الخلايا المصابة مشابهة لتلك التي كانت في ساعة واحدة. أظهر التصوير الكونفوكالي بعد 24 ساعة أن البكتيريا داخل الخلية استمرت في التكاثر لتكوين تجمعات شبيهة بالمجتمعات. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة ديناميكيات العدوى البكتيرية وتلك التفاعلات مع مسببات الأمراض في نموذج يحافظ على التنوع الخلوي الظلائي.
يمكن للدراسات المستقبلية استخدام هذا النموذج للتحقيق في أمراض البروستاتا المتنوعة، بما في ذلك العدوى، وبيولوجيا السرطان، واختبار المركبات العلاجية المحتملة.
Overview
This article presents a step-by-step protocol for generating a two-dimensional (2D) culture model derived from mouse prostate organoids. The model maintains key epithelial characteristics and allows direct access to the apical surface, enabling detailed studies of host-pathogen interactions, particularly with uropathogenic Escherichia coli (UPEC). The protocol includes organoid dissociation, cell seeding, differentiation, and infection procedures, validated by immunofluorescence and functional assays.
Key Study Components
Area of Science
- Prostate epithelial biology
- Host-pathogen interactions
- Organoid and cell culture models
Background
- Prostate diseases such as benign prostatic hyperplasia, prostatitis, and prostate cancer are prevalent in aging men.
- Organoid models replicate epithelial structure and function but limit access to the apical surface.
- Existing in vitro models do not fully capture the diversity of prostatic epithelial cells.
- Improved models are needed to study infection dynamics and disease mechanisms.
Purpose of Study
- To develop a physiologically relevant 2D culture system from mouse prostate organoids.
- To enable direct experimental access to the apical surface for infection studies.
- To validate the model's epithelial diversity and suitability for host-pathogen interaction research.
Methods Used
- Dissociation of mature mouse prostate organoids cultured in extracellular matrix.
- Seeding of dissociated cells onto 2D culture surfaces with optimized conditions for attachment and proliferation.
- Differentiation induction using dihydrotestosterone (DHT) supplementation.
- Infection of the 2D model with UPEC and analysis via immunofluorescence microscopy, TEER measurements, and flow cytometry.
Main Results
- The 2D model retained essential epithelial characteristics and cellular diversity.
- DHT supplementation modulated the balance between basal and luminal cell populations.
- UPEC adhered to and invaded epithelial cells, forming intracellular clusters observed by confocal microscopy.
- Gentamycin treatment effectively reduced extracellular bacteria, allowing study of intracellular infection dynamics.
Conclusions
- The 2D organoid-derived model provides a robust platform for studying prostate epithelial biology and host-pathogen interactions.
- It enables detailed investigation of infection dynamics and cellular responses.
- The model is suitable for future studies on prostate diseases and therapeutic testing.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Prostate organoid-derived 2D models address a critical gap in preclinical research by enabling direct interrogation of host-pathogen interactions at the epithelial barrier. This system preserves cellular diversity and barrier function, supporting predictive confidence in early-stage target validation and mechanistic de-risking for infection and prostate disease research. The platform's translational relevance positions it as a reusable asset for portfolio-wide evaluation of disease mechanisms and therapeutic strategies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables mechanistic interrogation of epithelial responses to uropathogenic Escherichia coli infection.
- Supports functional validation of host-pathogen interaction targets in a physiologically relevant context.
- Facilitates biological de-risking by modeling both basal and luminal cell populations.
- Improves predictive confidence for downstream infection biology studies.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible 2D epithelial system for quantitative infection assays.
- Enables direct access to the apical surface for compound or pathogen application.
- Supports TEER and immunofluorescence-based readouts for barrier integrity and cell differentiation.
- Allows scalable preparation for high-content screening of infection-modulating agents.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant epithelial biology for translational infection and prostate disease models.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation of host-pathogen mechanisms.
- Enables risk-adjusted advancement of therapeutic hypotheses targeting epithelial infection pathways.
- Supports evaluation of candidate interventions in a system reflecting in vivo cellular diversity.
Pipeline & Workflow Integration
This organoid-based 2D model bridges early discovery and preclinical infection research, enabling hypothesis testing, target validation, and quantitative readouts within a unified workflow.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of infection mechanisms and epithelial responses.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative infection and barrier function assays for compound evaluation.
- Analytics: Provides immunofluorescence, TEER, and flow cytometry outputs for robust condition comparison.
- Translational Research: Maintains disease-relevant cellular organization for preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform for diverse prostate disease and infection studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in infection biology.
- Operational Value: Standardizes epithelial infection assays with scalable, reproducible workflows.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio triage.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of infection and prostate disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in organoid culture, epithelial differentiation, and infection assays.
- Needs access to immunofluorescence microscopy, TEER instrumentation, and flow cytometry.
- Demands cross-team standardization of cell seeding, differentiation, and infection protocols.
- Adaptable to other epithelial models with protocol optimization for tissue specificity.
- Barrier function and cellular diversity must be validated for each experimental batch.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
3D Prostate Organoid Disruption into Single Cells
1:58
Plating Single-Cell Suspension onto a 2D Culture Surface
3:17
Preparation of Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) for Infecting the Organoids
5:12
Infecting the Prepared Prostate-Organoid Model with Uropathogenic Escherichia coli (UPEC)
6:16
Results
7:38
Conclusion
