صبغة البيروكسيسوم في خلايا الثدييات باستخدام مجسات خاصة بالبيروكسيسوم

لذا يركز بحثنا على فهم البيروكسيسومات، وهي عضيات أساسية لاستقلاب الدهون والتوازن التأكسدي الخلوي. نهدف إلى اكتشاف كيف يتم تنظيم هيكلها ووظيفتها وكيف تتغير هذه العمليات في المرض. لتحقيق ذلك، نطور مجسات فلورية تتيح لنا وللمجتمع العلمي الأوسع تصور البيروكسيسومات في مجموعة من الخلايا الحيوانية.

هنا، نطور بروتوكولات تلوين تعمل في الخلايا الحية والثابتة، مما يوفر أدوات قوية لدراسة بيولوجيا الباروكسيتين في الصحة وعلم الأمراض. أحد التحديات التجريبية الرئيسية هو تحقيق وسم غير جراحي للبيروكسيسومات في خلايا الحيوانات. بينما يساعد صبغ الأجسام المضادة في التغلب على ذلك، هناك نقص في الأجسام المضادة المتوفرة تجاريا للبروتينات الباروكيسمالية.

تحد آخر هو تصور البيروكسيسومات بشكل غير جراحي في الوقت الحقيقي، مما يتطلب بروتوكولات قابلة للتكيف. وأخيرا، التلوين التقليدي لا يوفر قراءة وظيفية. بينما يمكن أن يختلف التلوين القائم على البيروكسيداز حسب وظيفة انقطاع البكسيسمات، وهو تحد وفرصة في آن واحد، لأنه يسمح لنا بالتمييز بين الحالات الوظيفية النوبة داخل الخلية.

ابدأ بخلايا ثديية تم زرعها في اليوم السابق في صفيحة مع شرائح تغطية أصبحت الآن عند التقاء بنسبة 30 إلى 70٪. قم بتخفيف مسبار البيروكسسوم باستخدام وسط جديد في أنبوب حساس للضوء ومطرد مركزي دقيق لتحقيق تركيز نهائي بأربعة ميكروموللار. اختر البئر المطلوب للصبغ ووضع علامة على الخارج باستخدام قلم تحديد (قلم تحديد).

استنشق 0.5 ملليلتر من الوسائط من البئر المختار واستبدله بوسط المجس المحضر قطرة قطرة على طول جدار البئر. بعد الصرف، حضن الخلايا على درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 إلى 15 دقيقة. من هذه النقطة فصاعدا، قم بحماية الخلايا من الضوء باستخدام ورق الألمنيوم.

بعد الحضانة، قم بإزالة الوسط الملطخ بعناية واغسل الخلايا مرتين باستخدام PBS. ثم ضع اللوحة تحت غطاء كيميائي، أضف 4٪ بارافورمالديهايد في PBS إلى الخلايا، وحضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. بعد التثبيت، قم بإزالة بارافورمالديهايد إلى حاوية مخصصة للنفايات وغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام PBS.

بعد ذلك، أضف 0.5٪ ترايتون X في PBS لنفخ الخلايا وحضانة لمدة 2.5 دقيقة. بعد الحضانة، أزل جهاز Triton X واغسل الخلايا مرتين ب PBS لمدة 10 دقائق لكل منها. لحجب الخلايا، حضنها بألبومين مصل بقري بنسبة 5٪ في PBS طوال الليل عند درجة حرارة أربع درجات مئوية.

قم بإجراء عملية التلوين المناعي الفلوري وفقا للبروتوكول القياسي. وأخيرا، قم بإجراء التصوير المجهر لالتقاط صور لكل من الخلايا الثابتة والحية. أدى تلوين الخلايا الحية باستخدام مجسات Peroxi_SPY إلى استيراد كاسيت مرتبط ب ATP يعتمد على العائلة الفرعية D إلى البيروكسيسومات، مما أدى إلى نسبة فلورية عالية بين البيروكسيسوم والسيتوبلازم في الخلايا النشطة أيضيا.

في خلايا HEK-293T البرية التي تعبر عن GFP-SKL، أظهر التلوين Peroxi_SPY555 تزامنا واضحا مع البيروكسيسومات، بينما في خلايا PEX19 التي تفتقر إلى البيروكسيسومات، كان التلوين غائبا. في الأرومات الليفية البشرية، Peroxi_SPY التلوين يتزامن مع العلامة المنفصلة GFP-SKL، مما يؤكد استهداف البيروكسسوم. كشف قياس كثافة البيروكسسومات عن اختلافات كبيرة بين أنواع الخلايا المختلفة.

أدى تحسين ظروف التلوين في خلايا COS-7 باستخدام 250 نانومولر Peroxi_SPY لمدة 20 دقيقة إلى زيادة ملحوظة في نسبة الفلورة بين البيروكسيسوم والسيتوبلازم مقارنة ببروتوكول ميكرومولر واحد لمدة 10 دقائق أصلي. أدى الحضانة الممتدة لخلايا HEK-293T مع Peroxi_SPY لمدة 24 ساعة إلى تحسين نسبة شدة الفلورة بين البيروكسيسوم والسيتوبلازم مقارنة ب 15 دقيقة، رغم انخفاض تلوين البيروكسسوم. مكن بروتوكول تثبيت من تلوين الأجسام المضادة بنجاح تم إثباته من خلال حفظ العلامات Peroxi_SPY وصبغة مناعة مضادة PEX14 في خلايا HuH-7 وHEK-293T.

أظهرت القياسات أن إجراءات التثبيت والنفاذية أثرت على شدة الفلورة البيروكسيمية مقارنة بتلوين الخلايا الحية. لقد طورنا صبغة Peroxi_SPY التي يمكن استخدامها لرؤية البيروكسيسومات في الخلايا الحيوانية الحية والثابتة. يمكن لمسبار الفلورسنت لدينا أن يوفر طريقة بسيطة وسريعة لدراسة ديناميكيات البيروكسسوم، والتباين، والخلل بطرق كانت محدودة سابقا.

سيمكن هذا البروتوكول من البحث المعتمد على التصوير في أنواع الخلايا المختلفة، بما في ذلك الخلايا المشتقة من المرضى التي تعاني من اضطرابات انسيابية القلبية.