تنقية فعالة لببتيدات الإيلاستين الشبيهة بالإيلاستين (ELPs) من الإشريكية القولونية باستخدام طريقة الاستخلاص والترسيب المعتمدة على المذيب العضوي

يطرح نطاق هذا البحث ما إذا كان الترسب باستخراج المذيب يمكن أن ينقي بسرعة بروتينات اندماج ELP مع الحفاظ على وظيفة نشاط الاندماج. تشمل التطورات الحديثة تنقية ELP السريعة باستخدام المذيبات مع تحسين التحكم في السموم الداخلية، مما يمكن الجسيمات النانوية النشطة ذاتية التجميع لتوصيل الأحماض النووية المستهدفة. للبدء، قم بوزن جرام واحد من حبيبات خلايا الإشريكية القولونية.

أضف أربعة ملليلتر من محلول التحلل الطازج لإعادة تعليق حبيبة الخلية. استخدم الدوامة بلطف حتى تتشتت الحبيبات بالكامل وتخلط مع المخزن الكهربائي. أضف حوالي خمسة ملليغرامات من الليزوزيم إلى الخلايا المعلقة للمساعدة في هضم جدار الخلية.

ثم ضع الأنبوب على الثلج واحتضن لمدة ساعة. بعد الحضانة، يتم سونيك العينة باستخدام جهاز مجس صغير على فترات زمنية مدتها خمس ثوان. احتفظ بالعينة على الثلج واستمر في التصويب حتى يتم الحصول على تحلل موحد خال من الجسيمات المرئية، عادة لمدة خمس إلى ثماني دقائق.

قم بعمل طرد مركزي على جهاز سونيكات ليزات عند 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لتوضيح الأمر. ثم يفصل بعناية المادة الفائقة التي تحتوي على الجزء القابل للذوبان عن الحبيبة التي تحتوي على الجزء غير القابل للذوبان. قم بإخراج 10 إلى 20 ميكرولتر من المادة الفائقة وإعادة تعليق كتلة مكافئة للحبيبة في مخزن التحلل.

اخلط كلا الجزئين مع 4x مخزن Laemmli إلى تركيز نهائي 1x. ثم سخن نظام التعليق على درجة حرارة 95 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. إذا كان ELP قابلا للذوبان في الغالب، فتابع الاستخراج بالمذيب العضوي باستخدام الفائق المصفى.

لإجراء استخراج المذيب، أضف أربعة ملليلتر من المذيب العضوي أو خليط المذيب إلى الحبيبة المجففة بالهواء أو السوبرناتانت. بالنسبة لخلطات المذيبات الثنائية، استخدم نسب حجمية دقيقة، مثل ميلي لتر من كل نوع لتركيبة واحد إلى واحد. قم بتدوير نظام التعليق بقوة لمدة دقيقة واحدة لضمان اختراق المذيب بشكل صحيح في الحبيبة.

الآن، حضن الخليط عند 20 درجة مئوية لمدة خمس دقائق للسماح بتجمع البروتينات خارج الخلية وإذابة ELP في المرحلة العضوية. قم بالطرد المركزي للعينة عند 13,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية لفصل البروتينات القابلة للذوبان عن الحطام غير القابل للذوبان. اجمع المادة الفائقة بعناية دون إزعاج الحبيبات لأنها تحتوي على ال ELP المذاب.

قس حجم المادة الفائقة المجمعة بدقة استعدادا لهطول الأمطار. بعد ذلك، أضف الأسيتون أو الأسيتونيتريل إلى المادة الفائقة بحجم 2.33 ضعف حجمه لترسيب البروتين. حضن الخليط عند 20 درجة مئوية لمدة خمس إلى سبع دقائق.

قم بالطرد المركزي للعينة على حرارة 10,000 جرام لمدة 10 دقائق عند 20 درجة مئوية. ثم تخلص من المادة الفائقة وجفف الحبيبات في الهواء إما تحت تيار غاز نيتروجين لطيف لمدة 10 إلى 15 دقيقة أو بوضع أنابيب الطرد المركزي غير المغطاة مقلوبة على مناديل خالية من الوبر داخل غطاء بخار لمدة ساعة عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. أعد تعليق حبيبات البروتين المجففة في 50 ميكرولتر من PBS.

ثم استخدم الماصة بلطف لأعلى وأسفل لضمان الذوبان التام. احتفظ بالبروتين المعلق عند ناقص 20 درجة مئوية للاستخدام القصير إلى المتوسط. لإجراء التحقق باستخدام SDS-PAGE، امزج أولا البروتين المنقى مع 4x SDS-PAGE buffer loadload.

حل الدوامة لفترة وجيزة للتجانس. حمل العينة على جل SDS-PAGE بنسبة 10٪ ل ELP وTEEN الملتصقين لتشكيل الطفرة. شغل الجل على 100 إلى 120 فولت حتى يصل الغوص المتتبع إلى القاع.

الآن، صبغ الجل باستخدام صبغة InstantBlue Coomassie أو بديل مناسب لمدة ساعتين عند درجة حرارة 20 درجة مئوية. اشطف بالماء منزوع الأيونات حتى تحصل على خلفية واضحة. ظهر شريط بارز من ELP وTEEN اندمجهما لتشكيل شريط طفرات عند 100 كيلودالتون بعد خطوة تحلل قبل الاستخلاص العضوي.

أدت تركيبات المذيبات العضوية المختلفة إلى تنوع في كفاءة ونقاء استخراج ELP وTEEN التي اندمجت لدمج الطفرات في التشكيلة. خلطات AG وBG الفردية أعطت أعلى استعادة للبروتين. احتفظ مذيب AG المستخرج من ELP وTEEN اللذان اندمجتا لتكوين طفرات بحوالي 80٪ من نشاطه الإنزيمي مقارنة بالبروتين المنقى ب ITC، بينما احتفظ BG بحوالي 50٪ من النشاط، وأظهر التحكم V40 نشاطا شبه معدوم.

تشمل النتائج المهمة إثبات أن ترسيب استخراج المذيب العضوي ينقي بسرعة اندماجات ELP ذات السموم الداخلية المنخفضة مع الحفاظ على نشاط بروتين الاندماج. يعالج هذا البروتوكول نقص الطرق السريعة الخالية من المصارف لتنقية اندماجات ELP من الإشريكية القولونية مع أو بدون أجسام التضمين بدون وجود ITC متعدد الخطوات. يقدم هذا البروتوكول تنقية سريعة بخطوة واحدة مباشرة من حبيبات الإشريكية القولونية، مما ينتج اندماجات ELP نقية للغاية ومنخفضة السموم الداخلية مع الحفاظ على وظيفة بروتين الاندماج.