تحديد الكتلة الحيوية الميكروبية في التربة باستخدام جهاز PCR الرقمي للقطرات (ddPCR)

تستخدم دراستنا تقنية PCR الرقمية للقطرات وتسلسل الجينوم الكامل لقياس الكتلة الحيوية الميكروبية بدقة عبر أنواع التربة المختلفة. تتطلب الطرق التقليدية عينات كبيرة من التربة ومواد كيميائية ضارة. يستخدم ddPCR كمية قليلة من التربة لقياس الكربون المطلق للجينات والكتلة الحيوية.

للبدء، قم بتجميع كواشف مجموعة استخراج الحمض النووي في التربة لعزل الحمض النووي من ميكروبات التربة عند درجة حرارة غرفة 20 درجة مئوية. قم بتدوير أنبوب ضرب الخرز بحجم ملليتر لفترة وجيزة وتحقق من أن الخرزات قد استقرت في الأسفل. أضف 100 ملليغرام من التربة، ثم 800 ميكرولتر من محلول CD1 ودوامة لفترة وجيزة لخلطها.

استخدم جهاز تجانس مطحنة الخرز بسرعة ستة أمتار في الثانية لمدة 40 ثانية لتحليل العينة بدقة وقم بتوصيل أنبوب ضرب الخرزات بالطرد المركزي بقوة 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة لتحقيق تحلل الخلايا الميكانيكية. انقل المادة الفائقة التي قد تحتوي على جزيئات التربة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة ملليترين. أضف 200 ميكرولتر من محلول CD2.

دوامة لمدة خمس ثوان وجهاز طرد مركزي عند 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة. انقل ما يصل إلى 700 ميكرولتر من المادة الفائقة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق نظيف بسعة ملليتر دون الإخلال بالكربية. أضف 600 ميكرولتر من محلول CD3 إلى السوبرناتانت والدوامة لمدة خمس ثوان.

قم بتحميل 650 ميكرولتر من الخليط على عمود دوران وجهاز طرد مركزي بوزن 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة. تخلص من التدفق عبر التيار وكرر العملية للحصول على ما تبقى من الليزات. بعد ذلك، ضع عمود الدوران في أنبوب تجميع نظيف بسعة ملليترين.

أضف 500 ميكرولتر من محلول EA إلى عمود الدوران وجهاز الطرد المركزي عند 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة في درجة حرارة الغرفة. تخلص من التدفق السريع ووضع عمود الدوران مرة أخرى في نفس أنبوب التجمع. أضف 500 ميكرولتر من محلول C5 إلى عمود الدوران والطرد المركزي كما تم شرحه سابقا.

بعد التخلص من تدفق الماء، ضع عمود الدوران في أنبوب جمع جديد بسعة ملليترين وجهاز طرد مركزي على حرارة 16,000 جرام لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة. ضع عمود الدوران في أنبوب إخلاء جديد بسعة 1.5 ملليتر. أضف 50 إلى 100 ميكرولتر من محلول C6 إلى مركز غشاء المرشح في عمود الدوران.

الطرد المركزي عند 15,000 جرام لمدة دقيقة واحدة. تخزين الأنبوب الذي يحتوي على السائل عند أربع درجات مئوية بعد التخلص من عمود الدوران. قم بقياس الحمض النووي المستخرج باستخدام فلورومتر ومجموعة اختبار واسعة النطاق مزدوج السلسلة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

لتحليل البكتيريا والفطريات، اختر بادئات محددة من 16S rRNA و18S rRNA. بعد الذوبان، تضع دوامة جميع المواد الكيميائية على الجليد. قم بإعداد تفاعل بوليميراز القطرات الرقمي، أو ddPCR.

ضع خرطوشة مولد القطرات، أو DG8، في حامل الخرطوشة. أضف ما مجموعه 20 ميكرولتر من خليط التفاعل إلى كل بئر عينة في الخرطوشة. ثم أضف 70 ميكرولتر من زيت توليد القطرات لصالح إيفاجرين إلى الخرطوشة الموسومة جيدا بالزيت المحدد.

ضع الخرطوشة في مولد القطرات وغطها بحشية. نقل 40 ميكرولتر من القطرات الناتجة إلى كل بئر من صفيحة نصف متفرعة بسعة 96 بئر لتضخيم PCR. أغلق اللوحة باستخدام مادة ختم صفيحة مضبوطة مسبقا على 180 درجة مئوية لمدة خمس ثوان.

قم بضبط ملف دورة الحرارة واضبط الغطاء المسخن على 105 درجات مئوية. بعد الانتهاء من PCR، انقل لوحة 96 بئر إلى قارئ اللوحة. باستخدام نسخة كوانتاسوفت 2.1، قم بضبط عتبة السعة لفصل القطرات السالبة والموجبة.

من كل بئر، قيم المعايير، مثل عدد نسخ الجينات لكل نانوجرام من الحمض النووي، وإجمالي نسخ الجينات لكل نانوغرام من الحمض النووي المستخرج، ونسخ الجينات لكل جرام من الوزن الجاف للتربة المعالجة أثناء الاستخراج، وعدد الخلايا لكل جرام من الوزن الجاف للتربة. علاوة على ذلك، احسب كربون الكتلة الحيوية الميكروبية (MBC)، الذي يتوافق مع البكتيريا والفطريات لكل جرام من الوزن الجاف للتربة لكل بئر. أسفر التحليل الثلاثي للحمض النووي للتربة من خمسة مواقع عن تركيزات متوسطة للحمض النووي الميكروبي تتراوح بين 32 نانوجرام إلى 4,590 نانوجرام لكل جرام من التربة الجافة لكل عينة.

احتوت التربة B على أقل عدد من نسخ جين 16S rRNA بمتوسط 8.8 في 10 لقوة سبع نسخ جينية rRNA و18S بمعدل 4.6 في 10 مقابل قوة ستة نسخ لكل جرام من التربة الجافة. على النقيض من ذلك، كان لدى التربة E أعلى عدد من نسخ جينات rRNA ب 16S و18S بمتوسط 4.4 في 10 بقوة 9 و2.5 في 10 لكل جرام من التربة الجافة، مع اختلاف كبير عن جميع العينات الأخرى. بينما ظلت النسخ الفطرية متشابهة عبر التربة A وB وC وD، إلا أن أعداد البكتيريا في التربة D اختلفت بشكل كبير عن كل من B وE. لوحظ أعلى محتوى ميكروبي في التربة E، بينما تم العثور على أدنى محتوى ميكروبي في عينات مأخوذة من التربة B تختلف بشكل كبير عن A وD وE. يتيح هذا البروتوكول للباحثين قياس ديناميكيات وتركيب مجتمع التربة من خلال الكتلة الحيوية الميكروبية ونسبة الفطريات إلى البكتيريا.

يمكن استخدام نفس قالب الحمض النووي المستخدم في PCR الرقمي للقطرات لتسلسل الحمض النووي لتمكين مجتمع الميكروبات والتحليل الوظيفي.