تصوير الكالسيوم القائم على التألق في زراعات ظهارية مجرى الهواء الأولي باستخدام تقسيم الخلايا الآلي

تكشف عمليات النسخ الأحادية الخلية عن عدم تجانس في ظهارة مجرى الهواء الكيسي الليفية. نعتزم فهم كيف تؤثر وظائف وتغيرات نوع الخلية على مسببات المرض. التحدي الحالي هو قياس البروتيوميات والوظائف ذات الخلية الواحدة بدقة.

لا يزال هذا يتطلب تطويرا تقنيا. للبدء، حافظ على خلايا Calu-3 في قوارير T-25 تحتوي على وسط زراعة الوسط الأساسي الأدنى من إيغل مع 20٪ FBS و1٪ بنسلين ستربتومايسين. عندما تصل الخلايا إلى حوالي 70٪ من التقاء الجسم، غسل الخلايا بخمسة ملليلتر من PBS.

بعد الغسيل، أضف ملليتر واحد من تريبل مباشرة إلى الخلايا وضع القارورة في حاضنة مضبوطة على 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 10 إلى 15 دقيقة. ثم قم بتحييد جهاز TrypLE بإضافة أربعة ملليلتر من وسط الزراعة الكامل الطازج وامزج تعليق الخلية جيدا. قم بتغليف الخلايا في صفيحة بسعة 96 بئر عند التقاء تقريبا بنسبة 90٪ إلى 100٪، أي حوالي 40,000 خلية في كل بئر.

دع الخلايا تلتصق بصفيحة 96 بئر طوال الليل. غير الوسائط يوميا واستمر في زراعة الخلايا لمدة يومين إلى خمسة أيام بعد التقاء النقاط للسماح بالتمييز. في يوم التجربة، اغسل خلايا Calu-3 وحضنها بالأصباغ المناسبة.

بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر لكل بئر من بروبينيسيد 2.5 ملليمولر مخفف في محلول الكالسيوم للحفاظ على الصبغة داخل الفراغ السيتوبلازمي، ولف اللوحة بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء حتى التصوير. لخلايا مجرى الهواء الأولية. أزل الوسط الجانبي من الفتحة الجانبية واغسل الجانب القمي بإضافة 300 ميكرولتر من حاجز الكالسيوم.

ثم اغسل الجانب الجانبي بإضافة 750 ميكرولتر من محلول الكالسيوم. أزل المخزن عن طريق وضع الماصات وكرر الغسيل مرة أخرى على الجانبين. بعد ذلك، حضن الخلايا بمحلول صبغة 200 ميكرولتر على الجانب القمي و600 ميكرولتر على الجانب الجانبي القاعدي لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية و5٪ ثاني أكسيد الكربون.

خلال فترة الحضانة، حضر ثابسيغارجين مخففا في محلول الكالسيوم كمخزون متوسط بثلاث مرات. اضبط التركيز إلى ستة ميكروموللار لتحقيق تركيز نهائي قدره ميكرومولان في البئر. بعد الحضانة، قم بإزالة محلول الصبغة من كل من الحجرات القمية والجانبية عن طريق استخدام الماصات.

اغسل الخلايا مرتين باستخدام 300 ميكرولتر من حاجز الكالسيوم في الجانب القمي و750 ميكرولتر من حاجز الكالسيوم إلى الجانب الجانبي القاعدي. ثم أزل المخزن عن طريق التقطيع. بعد ذلك، أضف 100 ميكرولتر من بروبينيسيد 2.5 ملليمولر في مخزن الكالسيوم إلى الحجرة القمية، وأضف 500 ميكرولتر من نفس المحلول إلى الحجرة القاعدية الجانبية.

مع إبقاء إدخال الفتحة داخل اللوحة، لف اللوحة بالكامل بورق الألمنيوم لحمايتها من الضوء، ثم ضع اللوحة المغلفة جانبا للتصوير. افتح تطبيق فيجي. اختر الملف واختر فتح لرفع ملف الفيديو.

في نافذة المنبثقة الناتجة، احتفظ بجميع الإعدادات الافتراضية وأكد الاختيار. إذا رغبت، قم بضبط عرض الصورة باختيار الصورة، ثم اختيار التعديل، والنقر على تباين السطوع. تعديل سطوع وتباين قنوات الفلورة الفردية لتحقيق رؤية مثلى للخلايا.

لتسهيل تتبع الخلايا، قم بدمج القنوات باختيار الصورة، واختيار اللون، والنقر على دمج القنوات. في نافذة المنبثقة، قم بتعيين الملفات المناسبة لكل قناة على حدة وأكد الاختيار. للتتبع، اختر تحليل، اختر الأدوات، وافتح مدير العائد على الاستثمار.

في نافذة النافذة المنبثقة الناتجة، قم بتفعيل خياري عرض الجميع والتسميات. باستخدام أداة الاختيار الحر، تتبع الخلايا الفردية بعناية بناء على حدود الخلايا والصبغة النووية. ثم اضغط على زر T لإضافة كل خلية تتبع إلى قائمة العائد على الاستثمار.

تأكد من تتبع الخلايا في جميع زوايا مجال الرؤية الأربعة وفي وسط الفيديو. بمجرد تتبع جميع الخلايا بدقة، داخل نافذة مدير العائد على الاستثمار، انقر على المزيد واختر مقياس متعدد. في نافذة النافذة المنبثقة الناتجة، اضغط على موافق لبدء القياس.

افتح ملف الفيديو في فيجي. تحسين قنوات الفلورة النووية والخضراء للمشاهدة باستخدام أدوات ضبط الصورة. بمجرد تحسين القنوات، قم بتكرار إطار واحد باختيار الصورة واختيار التكرار.

في نافذة النافذة المنبثقة الناتجة، قم بإلغاء تحديد مكدس المكرر وحفظ الصورة المكررة كملف صورة PNG. كرر تكرار الإطار للقناة الأخرى باختيار Image واختيار Duplicate. في نافذة المنبثقة، اضغط موافق، واحفظ الصورة ملف PNG.

قم بدمج الصورتين المحفوظتين عن طريق اختيار الصورة، واختيار اللون، والنقر على دمج القنوات. ثم قم بتعيين كل ملف PNG للقناة المناسبة وتأكيد الدمج. رفع الصورة المدمجة إلى واجهة المستخدم بعد الرسومية الخلوية لإنشاء قناع خلية.

قم بتقسيم الصورة باستخدام الصبغة النووية كقناة واحدة وتكون الصبغة السيتوبلازمية هي القناة الثانية باختيار نموذج cyto3. الآن، احفظ صورة القناع المولدة كملف PNG. افتحها في فيجي وحولها إلى ملف TIFF.

وأخيرا، افتح كل من ملف القناع وملف الفيديو الأصلي في مجموعة الكالسيوم عن طريق سحبهما وإفلاتهما في واجهة البرنامج. انقر على تحليل البيانات لإنشاء مخطط قابل للتنزيل وملف CSV قابل للتحميل يحتوي على قيم شدة مطبعة وخام لجميع الخلايا المحللة. زادت شدة الفلورة التي تم تطبيعها إلى الأساس مع مرور الوقت في خلايا Calu-3 الفردية بعد تحفيز التابسيغارجين عند قياسها باستخدام كل من Fluo-4 AM و Cal-520 AM، وكان أقصى تنشيط للفلورية المعتمدة على الكالسيوم بعد التابسيغارجين أعلى بشكل ملحوظ في خلايا Calu-3 التي تم قياسها باستخدام Cal-520 AM مقارنة ب Fluo-4 AM. وبالمثل، أظهر مجرى الهواء الأولي والخلايا القصبية زيادة في التألق الطبيعي مع مرور الوقت بعد تحفيز التابسيغارجين باستخدام أي من الصبغتين.

بالإضافة إلى ذلك، كان تنشيط الفلورة المعتمد على الكالسيوم أعلى بشكل ملحوظ في الخلايا المحملة ب Cal-520 AM. حدد التحليل المعتمد على التعلم الآلي وقام بقياس تغيرات الفلورة المعتمدة على الكالسيوم في 1,441 خلية فردية، من مجال رؤية واحد. أظهرت آثار الفلورة الطبيعية التي يولدها البرنامج استجابات الكالسيوم لجميع الخلايا ال 1,441 المحددة بعد تحفيز التابسيغارجين. ستساعد دراساتنا في فهم استجابات أنواع الخلايا المختلفة تجاه بيئتها، مما سيساعد في تطوير علاجات مستهدفة.

لدى نتائجنا القدرة على التركيز على أنواع الخلايا المختلفة، لتحديد استجابات معينة للخلايا الحية للمحفزات البيئية. في المستقبل، نعتزم استكشاف كيفية تعديل الإشارات الخاصة بنوع الخلايا في الأمراض والخلايا السليمة لتحديد الأنواع المسؤولة.