إعداد قابل للتكرار للتصوير الثنائي الفوتوني في الجسم الحي لانقباض الأوعية اللمفاوية العنقية وتدفق اللمفاوف في الفئران

نعرض الحاجة إلى تصوير جديد لانقباض الأوعية اللمفاوية العنقية وإزالة خلايا الدم الحمراء في الفئران بواسطة اللمفاويات. دراسة وظائف الأوعية اللمفاوية العنقية أمر صعب، خاصة عندما يتطلب الأمر مراقبة طويلة الأمد لانقباض تدفق اللمفاوف ودوران التتبع الكهربائي. للبدء، ضع سكة بصرية فولاذية بطول 270 مليمترا وعرض 43 مليمترا كقاعدة للجهاز.

ركب حاملي أعمدة فوق السكة الفولاذية البصرية، لضمان مسافة 175 مليمتر بينهما. أدخل عمودين للتثبيت بقطر 12 ملم في حوامل الأعمدة وثبت كل واحد منهما باستخدام برغي M6. ثم قم بتثبيت طوق عمود على كل من عمودي التثبيت.

ثبت مشبك عمود ثابت بزاوية قائمة على أحد أعمدة التثبيت وثبته بإحكام باستخدام مسمار M6. أدخل عمود تثبيت بقطر 12 ملم في الفتحة الجانبية لمشبك العمود القائم. قم بتثبيت حامل مطبوع ثلاثي الأبعاد على عمود التثبيت الجانبي المدرج وثبته بإحكام باستخدام زوجين من براغي M3.

باستخدام الغراء القابل للشفاء بالأشعة فوق البنفسجية، قم بتثبيت غطاء زجاجي بقطر 12 ملم على الجانب السفلي من غلاف واقي مطبوع ثلاثي الأبعاد. ثم ثبت الغلاف الواقي على حامل الطباعة ثلاثية الأبعاد باستخدام زوج من اللولب/الصامولة M4. تركيب طاولة بانتوغراف دقيقة للحركة الرأسية على قاعدة السكة البصرية الفولاذية باستخدام مشبكين للطاولة ومجموعات من براغي M6 والصواميل والغسالات.

ثم ضع علبة مطبوعة ثلاثية الأبعاد بطول 155 ملم وعرضها 110 ملم على سطح الطاولة. تعمل هذه العلبة كخزان لتراكم محلول ملحي. غط نقطة اتصال الأسلاك بعنصر التسخين الأول بطبقة رقيقة من السيليكون.

ثبت حساس درجة الحرارة الأول على السجادة وأغلقه بالسيليكون. لحام أسلاك عنصر التسخين وحساسات درجة الحرارة بكابل متعدد الأسلاك. املأ نقطة الاتصال بالسيليكون وأغلقها باستخدام لفافة الانكماش.

ضع عنصر التسخين رقم اثنين وحساس درجة الحرارة رقم اثنين داخل الأسطوانة الرغوية. ثبت موصلات كابل الطاقة وزر الطاقة بجدران صندوق وحدة التحكم. قم بتركيب مزود طاقة تيار مستمر بجهد 24 فولت، ومحول تدرج للتيار المستمر، ووحدتي MOSFET داخل الحاوية.

بعد تجميع الدائرة ولحام المكونات المطلوبة، قم بتثبيت أردوينو أونو وشاشة لوحة المفاتيح في غلاف الغطاء. حدد موقع حقل اختيار درجة الحرارة. اضبط درجة الحرارة واضغط زر التشغيل.

بعد تخدير الفأر، ضع مرهم العين على كلا الجفنين لمنع جفاف كرات العين أثناء الجراحة. بمجرد توقف رد فعل سحب الساق الخلفية وردة فعل ثني الذيل، ضع الفأر على ظهره على عنصر التسخين لتوفير الوصول إلى منطقة البطن. قم بتوصيل وحدة التحكم بمأخذ كهربائي بجهد إدخال يتراوح بين 175 إلى 240 فولت تيار متردد.

باستخدام شريط طبي، ثبت جسم الحيوان في وضع مواز لسطح الطاولة، وضع الرأس بزاوية مع محور السهمية بحيث يستقر أحد جانبي الرقبة على الأسطوانة. لف رباطا حول القواطع العلوية وثبته في الجزء الخلفي من الجهاز واستخدم شريط طبي للمساعدة في الحفاظ على درجة حرارة جسم الحيوان. بعد ذلك، احلق الفراء من منطقة الرقبة.

ثم أزل أي شعر متبقي وغط الحيوان للحفاظ على الحقل المعقم. للتعقيم الأولي، قم بتعقيم جلد الرقبة باستخدام مسحة كحولية. ثم ضع محلول كلورهيكسيدين بنسبة 0.5٪ أو محلول يود بنسبة 2٪ للعلاج المطهر، وكرر عملية التعقيم مرتين إضافيتين.

بعد التأكد من عمق التخدير عبر رد فعل قرص إصبع القدم، قم بإجراء شق طولي على طول جلد الرقبة من الفك السفلي إلى عظمة الترقوة، بطول يقارب سنتيمترين. ثم أجري عملية شق اللفافة باستخدام مقص جراحي منحني. باستخدام ملقط منحني، ادفع الغدد اللعابية وعضلات الرقبة السطحية بلطف جانبا لكشف عضلة القصية الترقاء الترجي.

تأكد من عدم تلف الأوعية الدموية المرئية، وقم بترطيب المجال الجراحي باستمرار بالمحلول الملحي لمنع تلف الأنسجة. استخدم المقص الجراحي المجهري لإجراء عملية فتح عضلة القصية الترقاء العضلية، مما يوفر الوصول إلى المنطقة بين القصبة الهوائية والشريان السباتي. استمر في نشر العضلات واللفافة، مع إجراء كل من شق عضلة اللفافة.

بعد ذلك، حدد موقع العقدة اللمفاوية العنقية العميقة مع الأوعية اللمفاوية الواردة والصادرة على عمق يتراوح بين خمسة إلى سبعة مليمترات. ضع الجهاز الذي يثبت الحيوان الثابت على طاولة المجهر المتحركة. وثبت الجهاز في مكانه عن طريق تثبيته بإحكام بمسمار M6 لضمان الثبات أثناء التصوير.

ثبت القسطرة، المملوءة مسبقا بمحلول ملحي، على عمود التثبيت باستخدام شريط طبي. ضع بكرة بقطر سنتيمتر واحد تحت عنصر التسخين على جانب رأس الحيوان للحفاظ على ميل 45 درجة بالنسبة لطاولة المجهر. ثم تضع القسطرة الثابتة في منطقة الرقبة المفتوحة جراحيا بحيث تكون بالقرب من منطقة عظمة الترقوة في الحيوان وتشغيل إمداد الملح لملء تجويف الرقبة المفتوح بالمحلول الملحي.

خفض الغلاف الواقي فوق منطقة الرقبة المملوءة بالمحلول الملحي بحيث يكون الوعاء اللمفاوي في مركز مجال المراقبة. ثم ضع الغلاف الواقي على القصبة الهوائية دون ضغط عليه. وأخيرا، خفض عدسة الفوتونتين غير الغمر في الماء داخل الغلاف الواقي إلى العمق الصحيح بناء على مسافة العمل للعدسة وإجراء تصوير بصري ثنائي الفوتون للوعاء اللمفاوي العنقي.

بعد الإجراء، تم تأكيد التعرف الناجح على العقد اللمفاوية العنقية العميقة من خلال تراكم إيفانز بلو في الأنسجة. تم إجراء مراقبة ثنائية الفوتون لانقباض الأوعية اللمفاوية العنقية قبل وبعد التعديل الضوئي البيولوجي. أدى التعديل الضوئي الحيوية إلى زيادة كبيرة في انقباض الأوعية اللمفاوية العنقية في الفئران التي تبلغ من العمر شهرين و18 شهرا ذات شدة مماثلة.

أظهر التحليل الكمي أن انقباض الأوعية اللمفاوية العنقية كان أقل بشكل ملحوظ في الفئران التي تبلغ من العمر 24 شهرا مقارنة بالفئران التي تبلغ من العمر 2 و18 شهرا. ومع ذلك، لم تكن القيم مختلفة بشكل ملحوظ بين الفئران التي تبلغ من العمر شهرين و18 شهرا. زاد التعديل الضوئي الحيوي بشكل كبير من انقباض الأوعية اللمفاوية العنقية في الفئران التي تبلغ من العمر 2 و18 شهرا، لكنه لم يؤثر على الفئران التي تبلغ من العمر 24 شهرا.

لوحظت خلايا الدم الحمراء التي حقنت في البطين الجانبي الأيمن في الأوعية اللمفاوية العنقية بعد أربع ساعات من الحقن، واستمرت في التحرك عبر التجويف حتى خمس ساعات، مؤكدة تدفق الاتجاه من الدماغ إلى المحيط. يسهل بروتوكولنا المراقبة الحية لوظيفة الأوعية اللمفاوية العنقية مع الحفاظ على الانقباض لمدة تصل إلى خمس ساعات من المراقبة. توفر طريقتنا قابلية تكرار جيدة وتتوافق مع مختلف المجاهر ذات الفوتونتين وعدسات الهدف مع الحفاظ على صورة عالية الجودة بعمق يصل إلى 500 ميكرومتر.

يمكن أن تصبح هذه التقنية أداة عالمية لدراسة فسيولوجيا نظام تصريف الدماغ ووظائف الأوعية اللمفاوية العنقية.