زراعة الخلايا الغدية الصماء المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية عبر العضلات في الفئران
أبريل 10, 2026
نوفر بروتوكولا طفيف التوغل لزراعة العضلات لجزر الخلايا الجذعية المشتقة من خلايا البنكرياس البشرية إلى فئران تعاني من نقص المناعة لزرع الزراعة في الجسم الحي ، والتحليل اللاحق.
ندرس تطور البنكرياس الغادد الصماء باستخدام العين المستمدة من الخلايا الجذعية لفهم الأساس الجيني للسكري. زراعة الكبسولات التقليدية للكبسولة الكلى شديدة التوغل. يقدم بروتوكول زراعة الأعضاء داخل العضلات بديلا أبسط وأكثر قابلية للتكرار وأقل توغلا.
للبدء، أضف 0.5 ملليلتر من محلول مضاد الالتصاق بنسبة 5٪ لتغطية قاع صفيحة ميكروبئر ب 24 بئر تحتوي على آبار هرمية مقلوبة. قم بعمل الطرد المركزي على حرارة 1,300 جرام لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم افحص الآبار الصغيرة تحت المجهر بحثا عن فقاعات هواء.
بعد إعادة الطرد المركزي لللوحة، لإزالة أي هواء محبوس، استنشق محلول مضاد الالتصاق. ثم اغسل كل بئر ب 0.5 ملليلتر من PBS وكرر خطوة الغسل مرة أخرى. بعد ذلك، غسل البنكرياس المولع المطور من مركبات hPSC بملليلتر واحد من PBS مع 0.5 ملي مولر EDTA.
استنشق PBS ب 0.5 ملي مولر EDTA وغط الآبار بالتريبسين. ثم يحتضن عند 37 درجة مئوية لمدة ثماني إلى اثنتي عشرة دقيقة. قم بتخفيف التربسين بمجلدين من DMEM/F12 أو PBS وأعد تعليق الخلايا بلطف عن طريق استخدام الماصات.
انقل التعليق إلى أنبوب مخروطي وانتقل فورا إلى الخطوة التالية. قم بعمل جهاز التعليق المركزي على حرارة 200 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق السوبرناتينت بحذر وأعد تعليق الحبيبة بلطف في طبقة S4 متوسطة مدفأة مسبقا.
بعد ذلك، استنشق PBS من أطباق الميكروويل. أضف بلطف 1.25 ملليلتر من الخلايا المعلقة إلى كل بئر من صفيحة البئر الدقيقة. قم بطرد مركزي على الطبق بوزن 100 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة لتوزيع الخلايا بشكل متساو في الآبار الدقيقة.
انقل لوحة الميكروويل بحذر إلى حاضنة رطبة. لإجراء تغييرات في الوسائط باستخدام وسط التمايز، يتم استنشاق الوسط بلطف ووزعه على طول جدران البئر لمنع الاضطراب وإزاحة تجمعات الخلايا من الآبار الدقيقة. بعد نقل الكمية المناسبة من العناقيد المولدة إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليلتر، قم بتوصيل الحقنة بمجموعة أنابيب الإبر واملأها بوسط S7.
استنشق المجموعات إلى الأنبوب مباشرة من أنبوب الطرد المركزي الدقيق. اطو الأنبوب إلى نصفين وأدخل القسم المطوي في طرف ماصة سعة 200 ميكرولتر. ثم أدخل مجموعة إبرة أنبوب الطرف في أنبوب مخروطي بسعة 15 ملليلتر وثبت الأطراف على حافة الأنبوب باستخدام شريط لاصق.
قم بعمل طرد مركزي للأنبوب بقوة 100 جرام لمدة دقيقتين عند 4 درجات مئوية لضغط العناقيد ووضع الأنبوب فورا على الثلج. لزرع المجموعات في فئران غاما المخدرة من نوع NOD scid، قم بحلق الجانب الإنسي من الساق اليمنى أسفل الركبة وتعقيم ب 70٪ إيثانول. ثم افصل الأنبوب عن طرف الماصة ووصلها بالحقنة.
اقطع الأنبوب بالقرب من العناقيد المضغوطة وثبته في الطرف الخشن من الإبرة. ادفع المحلول الملحي حتى يصل أول تجمع إلى طرف الإبرة. ثم ضع الفأر مستلقيا، مائلا إلى الجانب الأيمن ومدد الساق اليمنى.
أدخل الإبرة بعمق أربعة إلى خمسة مليمترات في الحجرة الإنسية للفخذ الأيمن بين عضلة المقرب والعضلة الجروسيلس. ثم حقن العناقيد مع سحب الإبرة بحوالي ثلاثة مليمترات. قم بتدوير المحقنة، واسحب الإبرة، ودع الفأر يستعيد الحديث.
بعد التعافي من الطعم بعد ستة أسابيع من الزراعة وقطع الأنسجة، قم بإجراء التلوين المناعي لتمكين التحليلات التصويرية اللاحقة. تم تثبيت معلقات خلية واحدة من أسلاف البنكرياس في المرحلة الرابعة داخل صفائح ميكروبئر لتوليد تجمعات ثلاثية الأبعاد مضبوطة بالحجم. خلال 24 إلى 48 ساعة، تشكلت تجمعات كروية مدمجة.
أكد المجهر الفلوري وجود PDX1 وخلايا معبرة عن الأنسولين في خطوط hPSC المراسلة. بعد ستة أسابيع، تم رؤية موقع الطعم بشكل كبير مع وجود كتل تشبه العين داخل العضلة. بعد الاستئصال، كان يمكن التعرف على الفروع تحت المجهر الستيريو كهياكل كروية شاحبة.
لوحظ اكتشاف قوي لخلايا ببتيد C الإيجابية في الحيوانات المزروعة. أكد تلوين الأنسولين وجود خلايا بشرية شبيهة ببيتا داخل الطعم. تم اكتشاف خلايا إيجابية للجلوكاجون والسوماتوستاتين، مما يشير إلى الحفاظ على مجموعات خلايا ألفا ودلتا.
يسهل هذا البروتوكول إجراء اختبارات وظيفية في الجسم الحي وتقييم بقاء ونضج الطعوم البشرية المزروعة. أهم اعتبار هو ضمان تمايز الخلايا الجذعية عالية الجودة والتعامل اللطيف مع الخلايا أثناء تكوين التجمعات لتعظيم القدرة على البقاء وضمان بقاء الخلايا بشكل جيد. تسهل هذه النماذج استكشاف الآليات الجينية التي تكمن وراء مرض السكري أحادي التكوين وخلل خلايا بيتا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم مقالة JoVE هذه بروتوكولاً مفصلاً لزراعة جزر بنكرياسية مشتقة من خلايا جذعية بشرية متعددة القدرات (hPSC) في العضلات لدى الفئران التي تعاني من نقص المناعة. توفر هذه الطريقة بديلاً أقل توغلاً من الزراعة في كبسولة الكلية أو الزراعة تحت الجلد، مما يتيح وصولاً جراحياً مباشراً واسترجاعاً موثوقاً للطعم. ويدعم هذا البروتوكول تقييم وظيفة الجزر عبر قياس إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) في الجسم الحي بعد اختبار تحمل الجلوكوز عن طريق الفم، كما يسهل التحليل النسيجي اللاحق.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- الطب التجديدي
- العلاج بالخلايا الجذعية
- أبحاث السكري
خلفية علمية
- تُبشر الخلايا الغدية البنكرياسية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات المحفزة (hPSC) بإمكانيات واعدة في العلاج الخلوي لمرض السكري ونمذجة الأمراض.
- تطرح مواقع الزرع الحالية، مثل كبسولة الكلى أو الحيز تحت الجلد، قيوداً تقنية أو فسيولوجية.
- غالباً ما يكون الزرع داخل الجسم حيوياً لدراسة نضج ووظيفة الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية في سياق فسيولوجي.
- هناك حاجة إلى مواقع زرع قابلة للتكرار ويسهل الوصول إليها، تسمح باستعادة الطعم والتقييم الوظيفي.
الغرض من الدراسة
- توفير بروتوكول مفصل للزراعة العضلية للجزر شبه البنكرياسية المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC-derived SC-islets) في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.
- تمكين تقييم تطعم الجزر وبقائها ووظيفتها في موقع طفيف التوغل.
- دعم التقييم الوظيفي عبر اختبار إفراز الجلوكوز المحفز للإنسولين (GSIS) في الجسم الحي والتحليل النسيجي بعد عملية الزراعة.
- وضع إطار عمل قابل للتكرار لأبحاث السكري قبل السريرية باستخدام الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية.
الطرق المستخدمة
- تحضير ورص تجمعات جزر البنكرياس المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC).
- جراحة الزرع داخل العضلات في الفئران ناقصة المناعة.
- تقييم إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) داخل الجسم الحي بعد اختبار تحدي الجلوكوز الفموي.
- استعادة الطعم والتحليل النسيجي للتقييم بعد عملية الزرع.
النتائج الرئيسية
- الاستزراع الناجح وبقاء الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية متعددة القدرات البشرية (hPSC) في موقع الزرع داخل العضلات.
- الكشف عن إفراز الإنسولين الوظيفي استجابةً لتحفيز الجلوكوز عبر اختبار إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز (GSIS) في الجسم الحي.
- الاستعادة الموثوقة للطعوم من أجل التحليل النسيجي لتأكيد بنية الجزر والتعبير عن العلامات الحيوية.
- إثبات طريقة قابلة للتكرار وبأقل قدر من التدخل الجراحي لدراسات زرع الجزر في المرحلة قبل السريرية.
الاستنتاجات
- يُعد الزرع داخل العضل موقعاً قابلاً للتطبيق وسهل الوصول إليه لزراعة الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) في الفئران.
- يدعم هذا الإجراء التقييم الوظيفي للجزر المشتقة من الخلايا الجذعية من خلال اختبار إفراز الغلوكوز المحفز للإنسولين (GSIS) في الجسم الحي.
- يتيح استرجاع الطعم إجراء تحليل نسيجي وجزيئي شامل بعد عملية الزرع.
- يوفر هذا البروتوكول نموذجاً قبل سريري قابلاً للتكرار لدفع أبحاث العلاج الخلوي لمرض السكري.
الأسئلة الشائعة
الأهمية التنفيذية في القطاع الصناعي
يوفر الزرع العضلي للخلايا الغدية البنكرياسية المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات نموذجاً قبل سريري قابلاً للتكرار وبأقل قدر من التدخل الجراحي لتطوير العلاج الخلوي لمرض السكري. يتيح هذا النهج التقييم الوظيفي للجزر المشتقة من الخلايا الجذعية عبر قياس إفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز داخل الجسم الحي، ويدعم الاسترداد الموثوق للطعم من أجل التحليلات اللاحقة، مما يعالج القيود الرئيسية لمواقع الزرع التقليدية. تعزز هذه الطريقة الثقة التنبؤية في التقييم قبل السريري من خلال توفير سياق فسيولوجي لنضج الجزر ووظائفها، مع تحسين إمكانية الوصول الجراحي وتقليل التدخل الجراحي في الحيوانات.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية الحيوية
الاكتشاف المبكر والتحقق من صحة الهدف
- القيمة العلمية: تتيح اختبار الفرضيات العلاجية من خلال تقييم النضج الوظيفي للجزر المشتقة من الخلايا الجذعية في سياق فسيولوجي.
- القيمة التشغيلية: تدعم الحد من المخاطر البيولوجية من خلال ضمان تطعيم موثوق وإفراز إنسولين استجابةً للجلوكوز في الفئران التي تعاني من نقص المناعة.
- القيمة الاستراتيجية: تعزز الثقة التنبؤية في التحقق من الهدف من خلال توفير قراءات وظيفية قابلة للتكرار قبل مرحلة تحسين المركبات الرائدة.
الفحص وتطوير المقايسة
- القيمة العلمية: تجهيز أنظمة بيولوجية مصادق عليها لعمليات فحص المركبات اللاحقة من خلال تحقيق تطعيم وظيفي للجزر البنكرياسية.
- القيمة التشغيلية: توحيد إجراءات الزرع لضمان قابلية التكرار والتوسع في الدراسات قبل السريرية.
- القيمة الاستراتيجية: تعزيز جاهزية المقايسة من خلال تمكين المخرجات الوظيفية الكمية عبر اختبار GSIS في الجسم الحي لتقييم تأثير المركبات.
الأبحاث الترجمية وما قبل السريرية
- القيمة العلمية: يحافظ على الصلة بالمرض من خلال نمذجة وظيفة الجزر البشرية داخل الجسم الحي، مما يدعم مواءمة المؤشرات الحيوية الترجمية.
- القيمة التشغيلية: يضمن الاستمرارية من مرحلة الاكتشاف وصولاً إلى التحقق قبل السريري من خلال استرجاع الطعوم والتحليل النسيجي المتسق.
- القيمة الاستراتيجية: يدعم قرارات التقدم المعدلة حسب المخاطر من خلال توفير بيانات وظيفية وهيكلية حول تطعيم الجزر ونضجها.
تكامل مسار العمل والتدفق الإجرائي
تندمج هذه الطريقة في تسلسل عملية الاكتشاف من خلال دعم اختبار الفرضيات في مراحل الاكتشاف المبكرة، وتمكين توحيد المقايسات لعمليات الفحص، وتوفير قراءات وظيفية تفيد في تحديد المركبات الرائدة واتخاذ قرارات التطوير في المرحلة قبل السريرية.
- بيولوجيا الاكتشاف: تدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تقييم وظيفة الجزر في موقع زرع فسيولوجي.
- الفحص: تعزز جاهزية المقايسة من خلال عملية زرع موحدة وقياسات قابلة للتكرار لإفراز الإنسولين المحفز بالجلوكوز.
- التحليلات: توفر قياسات كمية للمتغير التابع عبر قياس GSIS في الجسم الحي لمقارنة وظيفة الطعم عبر ظروف مختلفة.
- البحث الانتقالي: ترتبط بالاستمرارية قبل السريرية من خلال تمكين التحليل النسيجي والجزيئي للطعوم المستخرجة لتقييم النضج.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: تؤسس منصة قبل سريرية قابلة لإعادة الاستخدام لدورات التصميم والاختبار التكرارية في تطوير علاجات السكري القائمة على الخلايا الجذعية.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تعزيز الثقة التنبؤية من خلال تقليل الغموض الميكانيكي في وظيفة ونضج الجزر المشتقة من الخلايا الجذعية.
- القيمة التشغيلية: تحسين التوحيد القياسي، وقابلية التكرار، وقابلية التوسع في إجراءات الزرع عبر مواقع البحث المختلفة.
- القيمة الاستراتيجية: تعزيز قرارات الاستمرار أو التوقف من خلال توفير بيانات وظيفية موثوقة، مما يقلل من المخاطر البيولوجية في المراحل المتأخرة من برامج علاج السكري.
- تأثير المحفظة: توجيه تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر من خلال التحقق الوظيفي والترقيع القابل للتكرار للجزر المشتقة من الخلايا الجذعية.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تمايز الخلايا الجذعية، وتقنيات الزرع الجراحي المجهري، والاختبارات الأيضية داخل الجسم الحي.
- يعتمد على بنية تحتية جراحية معقمة، وأنظمة اختبار تحمل الجلوكوز، ومقاييس الكشف عن الإنسولين للحصول على القراءات الوظيفية.
- يستلزم توحيد المعايير بين فرق معالجة الخلايا، والفرق الجراحية، والفرق التحليلية لضمان اتساق النتائج.
- يتضمن اعتبارات التكيف مع سلالات مختلفة من الفئران ذات نقص المناعة والجداول الزمنية لنضج الجزر.
- يتقيد بالحاجة إلى المراقبة بعد الجراحة وإجراءات استرداد الطعوم، مما قد يؤثر على إنتاجية الدراسات واسعة النطاق.
