إجراءات تحديد مثبطات دخول فيروس SARS-CoV-2 كمضادات فيروسات محتملة باستخدام الفيروسات الزائفة القائمة على MLV

تركز أبحاثنا على تحديد المثبطات التي تمنع دخول فيروس SARS-CoV-2 باستخدام أنظمة الفيروسات الكاذبة. دراسة إدخال فيروس SARS-CoV-2 غالبا ما تتطلب مختبرات احتواء عالية السلامة البيولوجية، عادة BSL-3. يتيح هذا البروتوكول إجراء فحص مضاد فيروسات آمن يستخدم في الفيروسات الزائفة في مختبرات BSL-2 القياسية.

للبدء، ضع لوحة زراعة أنسجة مكونة من ستة آبار في خزانة السلامة البيولوجية وزرع بذرة 7.5 في 10 إلى قوة خمس خلايا مشتقة من HEK 293 لكل بئر في اثنين ملليلتر من وسط كامل. حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون خلال الليل. في اليوم التالي، تأكد أن الخلايا وصلت إلى حوالي 50 إلى 60٪ من التلاصق.

في اليوم التالي، حضر محلول البولي إيثيلينمين أو PEI بإضافة خمسة ميكرولترات من كمية ملليغرام واحد لكل ملليلتر من PEI إلى 50 ميكرولتر من وسط مصل مخفض في أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر. في أنبوب طرد مركزي دقيق منفصل بسعة 1.5 مليليتر، جهز محلول الحمض النووي بإضافة 2.5 ميكروغرام من GFP معبرا عن البلازميد إلى 50 ميكرولتر من نفس الوسط. اخلط كل أنبوب لفترة وجيزة عن طريق الدوامة، ثم ادور للأسفل لمدة خمس ثوان وحضن الغرفة عند درجة حرارة الغرفة.

خلال فترة الحضانة التي تستمر 10 دقائق، قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر في صفيحة الستة آبار دون تعطيل طبقة الخلية الأحادية وأضف ملليلتر واحد من وسط النقل الكامل خال من المضادات الحيوية إلى كل بئر. بعد الحضانة، أضف 50 ميكرولتر من محلول الحمض النووي إلى الأنبوب الذي يحتوي على محلول PEI. اخلط بسرعة عن طريق الحقن ست مرات واحتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة ثلاث دقائق بالضبط.

ثم أضف بسرعة مركب الحمض النووي PEI بشكل إسقاطي إلى البئر المقابل. الآن، أغلق أطراف الصفيحة باستخدام بارافيلم وطرد مركزي على حرارة 1000 جيلون لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع باستخدام دوار متحرك ودلو لوحة. بعد الطرد المركزي، أزل الغشاء الباراميل بلطف وحضن اللوحة على درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاث ساعات.

ثم استبدل بلطف وسط النقل في كل بئر بملليلترين من وسط DMEM الكامل قبل التسخين المسبق. حضن الخلايا التي تم تحويلها عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 48 ساعة، وقيم كفاءة النقل من خلال تقييم تعبير GFP باستخدام المجهر الفلوري. زرع الخلايا المشتقة من HEK 293T في لوحين من 6 آبار كما أوضح سابقا.

خصص لوحا واحدا لتوليد فيروس شبه SARS-CoV-2 الشوكي، والآخر لفيروسات VSVG الزائفة. جهز خليط النقل ومركب الحمض النووي PEI في يوم التجربة وحضنه لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. أثناء الحضانة، قم بإزالة الوسط بعناية من كل بئر من الألواح الستة دون تعطيل طبقة الخلية الأحادية.

أضف ببطء ملليلتر من وسط النقل الكامل المسخن مسبقا بدون مضادات حيوية لكل بئر، مما يسمح للوسط بالجريان على جدار البئر. أضف مركبات النقل المحضرة إلى الخلايا لنقلها كما تم شرحها سابقا. بعد 48 ساعة من الحضانة بعد النقل، اجمع المواد الفائقة من كل بئر في أنبوب طرد مركزي مخروطي معقم بسعة 50 ملليلتر وجهاز طرد مركزي عند 290 جيلون لمدة سبع دقائق عند أربع درجات مئوية.

اجمع المادة الفائقة الخالية من الخلايا وتصفيتها عبر وحدة فلتر زجاجة علوية معقمة بحجم 0.45 ميكرومتر من البولي فينيليدين فلورايد. جهز مثلثات واحدة من المادة الفائقة المفلترة وتخزينها عند نقطة ضعف 80 درجة مئوية بذرة 2.5 مضروبة 10 لقوة أربع خلايا HSI، وهي خط خلايا شديدة الحساسية لفيروس SARS-CoV-2 في 50 ميكرولتر من DMEM كامل لكل بئر في صفيحة زراعة نسيج بسعة 96 بئرا. جهز ووضع علامات على آبار ثلاثية لكل حالة سيتم اختبارها، بما في ذلك عدوى الفيروس الزائف بدون شرارة وأنظمة التحكم غير المصابة.

حضن الصفيحة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون خلال الليل. في يوم التحويل، قم بإذابة قطعة واحدة من كل دفعة فيروس زائف على الثلج وامزج بلطف عن طريق العكس، بما في ذلك أليكوت واحد من السيطرة بدون شوك. أضف الكميات المطلوبة من تحضير الفيروسات الزائفة مباشرة إلى الآبار المخصصة.

اضبط حجم كل بئر إلى 150 ميكرولتر مع DMEM كامل. الآن، أغلق اللوحة بطبقة بارا فيلم وطرد مركزي على حرارة 2,500 جرام لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع. أزل ختم البارافيلم وحضن اللوح لمدة 72 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد الحضانة، جهز كواشف اختبار اللوسيفيراز وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإذابة ركيزة اللوسيفيراز ومخزن تحلل اختبار اللوسيفيراز 5X في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. قم بتخفيف مخزن تحلل اختبار اللوسيفيراز 5X إلى 1X باستخدام ماء معقم.

استنشق السوبرناتانت بعناية وتخلص منه. بعد ذلك، أضف 30 ميكرولتر من مخزن التحليل 1X لكل بئر. ضع الطبق على جهاز هزاز الطبق وركه لمدة 10 دقائق بسرعة 150 دورة في الدقيقة في درجة حرارة الغرفة.

تحقق من تحلل الخلايا الكامل تحت مجهر مقلوب للتأكد من أن الخلايا تم تحللها بالكامل وغير قابلة للتمييز. ثم انقل الليزاتات إلى صفيحة بيضاء معتمة بحجم 96 بئر. أضف 50 ميكرولتر من ركيزة اللوسيفيراز إلى كل بئر.

اخلط لفترة وجيزة بتحريك اللوح بلطف في حركة دائرية وضع اللوح داخل جهاز قياس الضوء وقيس التلميع. البذور 2.5 في 10 بقوة أربع خلايا HSI في 50 ميكرولتر من DMEM الكامل لكل بئر في صفيحة بئر 96 كما هو موصوف سابقا. حضن الزراعة طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي، جهز واحدة إلى ثلاث عمليات تخفيف تسلسلية للمركبات التي سيتم اختبارها مثل الأريبيدول في DMEM كامل يحتوي على 0.5٪ ثنائي ميثيل سلفوكسيد. باستخدام ماصة متعددة القنوات، استنشق الوسط بلطف من كل بئر. أضف 50 ميكرولتر من التخفيف المركب المقابل لكل بئر مع إضافة DMEM كامل إلى بئر التحكم في العمود 12.

حضن لمدة ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. دون إزالة المركبات، أضف مباشرة 50 ميكرولتر من فيروس SARS-CoV-2 الشائك إلى كل بئر مخفف في وسط كامل يحتوي على نفس تركيزات المركبات. أغلق اللوحة بغشاء بارفاميل.

الطرد المركزي عند 2,500 جرام لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة دون انقطاع. بعد إزالة البارفيلم، حضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. وأخيرا، قم بقياس العدوى باستخدام اختبار اللوسيفيراز كما تم إثباته سابقا.

أدى نقل الخلايا المشتقة من HEK 293T ذات PEI المتفرع إلى كفاءة نقل عالية مما أدى إلى حوالي 70٪ خلايا إيجابية ل GFP. بعد 48 ساعة من النقل. أظهرت إصابة خلايا HSI الحساسة بكميات متناقصة من فيروسات SARS-CoV-2 الزائفة أو VSVG زيادة في التلميع تعتمد على الجرعة مع زيادة مدخلات الفيروسات الزائفة.

أظهرت فيروسات زائفة أقل من الشوكة والخلايا غير المصابة مستويات منخفضة جدا من التلميع. تم اختبار مركب الأربيدول لقدرته على تثبيط دخول الفيروسات الزائفة، وأنتج تثبيط واضح لاستجابة الجرعة لنشاط اللوسيفيراز الناتج عن فيروسات شبه الشوكة مع تثبيط أقل لوحظ لفيروسات VSVG الزائفة. أظهر الاختبار عامل Z أولي 0.54، مما يشير إلى ملاءمة لأغراض الفحص.

العلاج بالأربيدول بتركيزات تبدأ من 30 ميكرومولار لم يؤثر بشكل كبير على بقاء الخلايا مقارنة بالخلايا التي عولجت بمركبة كبريتات ثنائي ميثيل 0.5٪ فقط. مكن هذا البروتوكول من إنتاج فيروسات زائفة عالية العداد من خلال ظروف محسنة. يتيح ذلك للباحثين قياس دخول الفيروسات الزائفة وتحديد المركبات التي تثبط العدوى الناتجة عن ارتفاع فيروس SARS-CoV-2.

تعد كفاءة النقل العالي ضرورية لتوليد فيروسات زائفة عالية القياس والحصول على إشارات عدوى موثوقة في الفحوصات اللاحقة. يدعم هذا النظام الفحص المضاد للفيروسات عالي الإنتاجية وتقليل قيمة مثبطات الدخول ضد متغيرات SARS-CoV-2 الناشئة، ويمكن تكييفه بسهولة لتوليد فيروسات زائفة تعرض بروتينات الغلاف من فيروسات أخرى.