رسم خرائط على مستوى الجينوم لتعديلات الهيستون ومواقع ارتباط عوامل النسخ في خطوط خلايا سرطان الرئة الصغيرة للغدد الصماء العصبية باستخدام تقنية CUT&RUN

لذا فإن هدف بحثنا هو تحديد التفاعلات بين عوامل النسخ التي تحدد النسب وبروتينات إعادة تشكيل الكروماتين في أنواع سرطان الرئة الصغيرة المختلفة، في تنظيم مشهد النسخ، وكيف يمكن لهذه التفاعلات أن تسهم في عمليات المرض، بما في ذلك بدء السرطان وتقدمه. نهدف إلى تحقيق ذلك من خلال إجراء تجارب مثل CUT&RUN، وهي تقنية تسلسل من الجيل القادم يمكنها تحديد المواقع الجينومية التي تتغير فيها هذه الهيستونات بشكل تفاضلي وعوامل النسخ المرتبطة بالحمض النووي. في النهاية، نأمل في تحديد مسارات جديدة منظمة فوق الوراثي قد تكون قابلة للتنفيذ علاجيا في تطوير علاجات جديدة للمرضى المصابين بهذا النوع العدواني جدا من سرطان الرئة.

للبدء، قم بإزالة الخلايا العصبية الصماء لسرطان الرئة الصغيرة المزروعة من حاضنة 37 درجة مئوية وفحصها تحت المجهر لضمان جودتها. ثم انقل تعليق الخلية إلى أنبوب مخروطي بسعة 50 مليليتر وقم بطرد مركزي الأنبوب بحرارة 1,200 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة. استنشق الوسط من الأنبوب المخروطي باستخدام الفراغ في الغطاء وشطف الحبيبات الناتجة ب 20 ملليلتر من PBS.

قم بعمل الطرد المركزي في الأنبوب مرة أخرى بقوة 1,200 جرام لمدة خمس دقائق، ثم استنشق جهاز PBS. أضف أكوتاز بناء على حجم الحبيبات وحضن الحبوب لمدة ثلاث إلى خمس دقائق عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لهضم حبيبات الخلية. بعد ذلك، إنهاء الهضم بإضافة خمسة ملليلتر من PBS مع 10٪ FBS وخلط للحصول على تعليق خلية واحدة.

بعد طرد الخلايا مرة أخرى كما أوضح سابقا، أعد تعليق الحبيبات في خمسة ملليلتر من PBS. عد الخلايا المبتدئة وتأكد من صلاحيتها وسلامتها باستخدام عداد الخلايا التلقائي. احسب إجمالي عدد الخلايا المطلوبة وأضف 20٪ فائض لأخذ أخطاء التوصيل في الاعتبار

انقل العدد الإجمالي المحسب للخلايا إلى أنابيب بسعة 1.5 ملليلتر وقم بطرد مركزي الأنابيب عند 600 جرام لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. أعد تعليق الخلايا في مخزن الغسيل بكثافة خمسة أضعاف 10 إلى قوة خمس خلايا في كل تفاعل، ليصبح المجموع ست تفاعلات. استخدم 100 ميكرولتر من المخزن في كل تفاعل واستخدم الماصة بلطف ولكن بشكل دقيق لضمان تعليق متجانس.

قم بعمل الطرد المركزي للخلايا مرة أخرى، وأزل السوبرناتان، وكرر عملية الغسيل. أليكوت 100 ميكرولتر من الخلايا المغسولة في كل أنبوب من مجموعة من ثمانية شرائط تحتوي على 10 ميكرولترات من خرزات كونكانافالين A المنشطة. استخدم الماصة بلطف لخلط المحتويات.

حضن خليط خلية الخرزة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة للسماح للارتباط الخلوي بالخرز، وقم بتدوير الأنابيب بسرعة في جهاز طرد مركزي صغير لجمع العجينة دون السماح للخرزات بالاستقرار. ضع الأنابيب على رف مغناطيس بسعة 0.2 مليليتر. اترك العجينات تتخلص واستخدم الماصة لإزالة الفائق.

ثم أزل الأنابيب من المغناطيس. أضف فورا 50 ميكرولتر من حاجز الأجسام المضادة الباردة في كل تفاعل وقم بعمل الماصة بلطف لإعادة تعليق الخرز. ضع ملصقات على أنابيب الشريط الثمانية بشكل مناسب.

أضف 0.5 ميكروغرام من كل من H3K4me3 و H3K4me1 وأجسام مضادة من الغلوبولين المناعي G و0.6 ميكروغرام من الأجسام المضادة متعددة النسيلات E2F7 من مصادر مختلفة إلى كل أنبوب تفاعل. استخدم الماصة بلطف لخلط محتويات كل أنبوب تفاعل جيدا وحضنها طوال الليل على جهاز نوتاتور عند درجة حرارة أربع درجات مئوية مع رفع أغطية الأنابيب. قم بإزالة الأنابيب الثمانية من النوتاتور وقم بدوران سريع لجمع السائل في أسفل كل أنبوب.

الآن ضع الأنابيب على حامل المغناطيس حتى يزول الخليط السائل. ثم استخدم الماصة بعناية لإزالة وتخلص من السوبرناتانت. مع إبقاء الأنابيب على حامل المغناطيس، اغسل كل أنبوب مرتين باستخدام 200 ميكرولتر من مخزن نفاذية الخلايا الباردة واستخدم ماصة متعددة القنوات لإزالة المادة الفائقة بعد كل غسل.

بعد ذلك، أزل الأنابيب من حامل المغناطيس. أضف فورا 50 ميكرولتر من العزل النافذ للخلايا الباردة إلى كل تفاعل واستخدم الماصة بلطف لإعادة تعليق الخلايا والحبيبات. ثم أضف 2.5 ميكرولتر من نوكلياز البروتين AG-micrococcal لكل تفاعل وامزج جيدا عن طريق التوصيل بلطف.

بعد حضانة لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة، قم بتدوير سريع للأنابيب. أعدها إلى حامل المغناطيس حتى يزول الخليط السائل، ثم أزل السوبرناتان. بعد غسل الخرزات مرتين باستخدام محلول نفاذية الخلايا البارد، أعد تعليقها بلطف في 50 ميكرولتر من المخزن النفاذ.

أثناء إبقاء الأنابيب على الثلج، أضف ميكرولتر واحد من كلوريد الكالسيوم 100 ملليمول إلى كل تفاعل في شريط الأنابيب الثمانية من الخطوة السابقة. استخدم الماصة بلطف لإعادة تعليق الخرز بالكامل وتعزيز الهضم الفعال. حضن الأنابيب على جهاز نوتاتور عند درجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة ساعتين، مع الحفاظ على رفع أغطية الأنابيب طوال فترة الحضانة.

الآن في أنبوب جديد بسعة 1.5 ملليتر، جهز خليط الإيقاف عن طريق دمج 33 ميكرولتر من محلول الإيقاف مع ميكرولتر واحد من ارتفاع الإسكيريشيا قولوني في الحمض النووي بمقدار 0.5 نانوغرام لكل تفاعل. استخدم دوامة لطيفة لخلط المحلول. في نهاية فترة الحضانة التي تستمر ساعتين، أضف 33 ميكرولتر من خليط الإيقاف المؤقت المحضر إلى كل أنبوب تفاعل وامزجه جيدا.

حضن أنابيب التفاعل في جهاز التدوير الحراري عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. بعد دوران سريع، ضع الأنابيب على رف مغناطيس حتى يصبح المحلول واضحا. انقل بعناية حوالي 85 ميكرولتر من المادة الفائقة التي تحتوي على حمض نووي إطلاق CUT&RUN إلى أنابيب جديدة بحجم 1.5 مليليتر.

قم بتنقية الحمض النووي المستعاد، وتقييم كميته، وإجراء توزيع حجم الشظايا لمراقبة الجودة. ثم تابع تحضير المكتبة بنظام CUT&RUN، والقياس، وتجميع المكتبات المفهرسة، وتسلسل الجيل التالي في النهايات الزوجية. خطوط الخلايا عالية المتماثل الأشييت-1، DMS79 وH146، وعامل التمايز العصبي 1 عالي السلالات، نما H82 كمجموعات غير ملتصقة أو كروية مدمجة معلقة، بينما أظهر H446 شكلا مختلطا، مع حوالي 80٪ خلايا فطرية و20٪ في التعليق.

كشف تحليل شظايا الحمض النووي من CUT &RUN أن علامة الهيستون المحسن H3K4me1 أعطت أعلى كميات DNA عبر جميع خطوط الخلايا، تليها H3K4me3، مع حصول E2F7 وIgG على أقل مقدار. بالنسبة للحمض النووي المستخرج من CUT &RUN، أظهر توزيع حجم الشظايا ل H3K4me1 و H3K4me3 قمم واضحة للنوكليوسوم الأحادي والثنائي النيوكليوسوم إلى جانب الحمض النووي الجيني. على النقيض من ذلك، لم يتم اكتشاف أي قمم مميزة ل E2F7 أو التحكم في IgG.

على الرغم من انخفاض مدخلات الحمض النووي، تم بناء مكتبات تسلسل الجيل التالي بنجاح لجميع أهداف CUT&RUN، بما في ذلك E2F7 وIgG. أظهر تحليل خرائط الحرارة في الخلايا الطفرية غير المتجانسة من النوع البري DMS79 وH146 المتغاير أن إشارات H3K4me3 و E2F7 كانت غنية بالقرب من مواقع بدء النسخ، في حين كانت إشارات H3K4me1 أكثر انتشارا. أظهر تصور متصفح الجينوم في منطقة كروماتين مختارة عشوائيا قمم مميزة ل H3K4me3 و H3K4me1 و E2F7، بينما لم يظهر IgG أي إثراء.

ولذا تقليديا، استخدم العلماء والباحثون التكرار المناعي الكروماتين يليه التسلسل أو ChIP-seq للإجابة على أسئلة مثل تلك التي نطرحها. ومع ذلك، يتطلب ChIP-seq كمية كبيرة من مواد الإدخال، وهو أمر ليس ممكنا دائما، حسب النموذج المستخدم. أما CUT&RUN، فيتطلب مواد إدخال أقل بكثير، تصل إلى 50,000 خلية، ويتطلب قراءات تسلسل عالية الإنتاجية أقل، مما يعني أنه أقل تكلفة، وينتج خلفية أقل بكثير عند توليد البيانات.

تقنية CUT & RUN هي تقنية يمكن تطبيقها ليس فقط على الخلايا في الزراعة ثنائية الأبعاد، بل يمكن تكييفها أيضا لنماذج ما قبل سريرية أخرى، مثل العضويات المشتقة من المرضى والكرات الفضائية. يمكن أيضا استخدامه لرسم شكل الكروماتين في الأنسجة، بما في ذلك الأنسجة الطبيعية والمريضة. لذا فهذه تقنية أو تقنية مفيدة للغاية لباحثي السرطان، لكنها قد تكون مفيدة جدا أيضا للباحثين غير السرطانيين الذين يركزون على دراسة أمراض بشرية مختلفة.

يسمح هذا البروتوكول برسم خرائط لتعديلات الهيستون والملفات الثابتة للبروتينات المتنوعة الموجودة في الجينوم الخلوي. توفير PTMs الهيستونية وارتباط TF عبر الأنواع الفرعية ل SCLC قد يكشف عن جينات وعناصر تنظيمية محددة بنوع فرعي، مثل المعززات والمحسنات الفائقة.