التحول الفعال القائم على التجدد القائم على الزراعة الجرو بكتيريا لنوع من البراصفة البرمائية اللاجنسية، Rorippa aquatica

نعالج نقص خط تحويل البكتيريا الزراعية البسيط والقابل للتوسع للنباتات اللاجنسية، مما يتيح التحليلات الجزيئية لوظائف الجينات. مؤخرا، قدمت دراسات الجينوم الكامل والتعبير الجيني الفسيولوجي روريبا أكواتيكا كنموذج للحبة غير المتجانسة. وهو مفيد في دراسة الأساس الجزيئي لتكيف الأرض مع الماء.

للبدء، اختر نباتات مركبة عمرها شهران تظهر أوراقا صحية مع هوامش كاملة. جهز صينية تكاثر النبات بقياس 20 × 30 سنتيمترا، مع طبقتين من مناشف الورق الخاصة بالأوتوكلاف. اطو المناشف الورقية بعناية وتشبعها بماء معقم حتى تبقى طبقة رقيقة من الماء على السطح.

تأكد من تجهيز طاولة المختبر بكمية تتراوح بين 100 إلى 500 ملليلتر من الماء المقطر المزدوج، وحاويات معقمة مناسبة للحجم المتوقع من اللقاح المعلق، وماصة دقيقة، وأطراف ماصات مناسبة. الآن، قم بإزالة 10 أوراق عند قاعدة البتلة من النباتات المختارة باستخدام المقص، وضعها في طبق بتري يحتوي على ماء معقم. بعد ساعتين ونصف، قم بعمل ماصة بحجم 50 ميكرولتر من المادة الفعالة لكل لتر من محلول إعادة التعليق لتحقيق تركيز 0.005٪ من مادة السورفاكترون.

حرك القارورة بلطف لخلط المحلول وتأكد من أن صينية التكاثر المعدة متاحة لوضع الزراعة بعد التطعيم. الآن ضع ورقة بحيث يكون الجانب السفلي متجها للأعلى. باستخدام مشرط، قم بقطع الضلع الأوسط للورقة بشكل عمودي إلى قطع بطول سنتيمتر واحد، وضعها في أنبوب سعة 50 ملليلتر مناسب للاستخدام في خلاط الأنابيب الدوار ليعمل كمزلاج للتطعيم.

صب لقاح البكتيريوم الزراعي في الأنبوب بحجم يكفي لتشبع جميع المواد المستخرجة بالكامل. ضع الأنبوب على خلاط دوار وحرك في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق لإجراء التطعيم. ثم باستخدام الملقط، قم بإزالة جميع الأوراق المختصرة من المحلول، وضعها مباشرة في صينية التكاثر المحضرة.

افصل وافرد النباتات المنقوعة بشكل متساو بحيث تغمر جزئيا ولكن ليست مغمورة بالكامل في طبقة الماء الرقيقة فوق المناشف الورقية المشبعة. بعد ذلك، أغلق صينية التكاثر بغلاف بلاستيكي. ضع الصواني في بيئة مظلمة واحتضن الحوض عند درجة حرارة محيطة تبلغ 22 درجة مئوية لمدة ثلاثة أيام.

بعد انتهاء فترة الحضانة المظلمة، تأكد من أن الصواني تبقى مغلقة بغلاف بلاستيكي شفاف. ثم أضف ماء مقطر مرتين إلى الصواني حسب الحاجة للحفاظ على مستويات الرطوبة. انقل صواني التطعيم إلى غرفة نمو وحافظ عليها تحت ظروف التكاثر النباتي.

افحص بصريا نباتات الوردة المعاد تجديدها للتأكد من ملاءمتها للزرع. حدد المثالي بتأكيد وجود ممر سليم بأوراق وجذور متعددة يبلغ طولها على الأقل من اثنين إلى ثلاثة مليمترات. ثم قم بإزالة نباتات الوردة المعدلة وراثيا سليمة باستخدام الملقط.

نزرع النباتات المستخرجة تحت نفس الظروف المستخدمة في التجددات المستنسخة البرية. قم بإزالة نبات وردي مشتعل مع تجنب ملامسة الأوراق المعدلة وراثيا بعناية. قم بتقليم الأوراق الزائدة المحيطة مباشرة بالورقة المعدلة وراثيا وازرع نبتة واحدة لكل أصيص.

بعد تسميد كل نبات مزروع، اسقها جيدا، ورش الأوراق بالرش، وضع النباتات تحت الظروف المناسبة. وأخيرا، أعد النباتات التي تحتوي على محولات تفتقر إلى البراعم والجذور أو تبدو صغيرة جدا بحيث لا يمكن نقلها إلى صينية التكاثر. استمر في فحص هذه النباتات المستقيمة ونقلها بمجرد أن تنمو بشكل كاف.

الغالبية العظمى من شتلاتنا ذات الشهر الواحد، التي كانت ذات T 1، أظهرت أنماط تعبير الياقوت الكيميرية، بينما أظهر عدد قليل منها أوراقا معبرة بالكامل عن الياقوت. تم الحفاظ على طفل ناضج يبلغ من العمر ستة أشهر، وكانت شتلة واحدة من نوع T 1 تعبرنا عن تعبير ياقوت كيميري. كانت قطاعات الأوراق المصبوغة بالياقوت الكيمري التي تم استخراجها من شتلات ال One T 1 قادرة على التكاثر اللاجنسي.

تجددت قطع الأوراق الكيميرية المقطوعة إلى إما تعبير كامل عن الياقوت أو الكيميرية، حيث تنمو نباتات واحدة من نوع T واحد خلال أسبوعين إلى أربعة أسابيع بعد الاستئصال مع تكوين جذور مرئية أثناء التجدد. بعد شهر واحد، أظهرت معظم شتلتي T 1 لدينا أوراق ياقوت في الغالب. يتجاوز بروتوكولنا خطوات زراعة الأنسجة المعقمة ويوفر خط تجدد تحول للنباتات اللاجنسية التي تكاثر نباتيا وتفتقر إلى بذور أو أزهار.

توفر دراساتنا حول تنشيط مسار الإيثيلين في نباتات روريبا أكواتيكا تحت الغمر رؤى رئيسية حول استجابات الغمر النباتي الأرضي. طريقتنا تفتح الباب للتحقيق في كيفية تمكين مسارات الضوء والهرمونات لهذا النبات البرمائي من التحول تحت الماء.