رني المترجمة خارج الرحم والتعبير الجيني في المستنزف الطبية

تعد العلقة الطبية نظاماً نموذجياً مفيداً للدراسات البيولوجية العصبية نظراً لبساطتها، وسهولة الوصول إليها، وإمكانية تحديد عصبونات ثابتة باستخدام العديد من الأدوات التجريبية المختلفة بدءاً من المراحل المبكرة من التكوين الجنيني وصولاً إلى الشيخوخة. ومن الاستخدامات المثيرة للاهتمام بشكل خاص للجنين في العلقة هي دراسات التصوير الزمني لنمو الزوائد العصبونية في الحيوان الحي والسليم، وذلك عقب إجراء تعديلات دقيقة للغاية على التعبير الجيني في العصبون قيد الدراسة أو في أهدافه. ونعرض في هذا الفيديو تقنية جديدة للتوصيل الموضعي السريع والدقيق للكواشف إلى الطبقات الداخلية للأجنة الحية للعلقة، وذلك باستخدام مسدس شعري يعمل بضغط الهواء تم تطويره من خلال تعاون بين مختبر أليكس غروسمان ومختبرنا.

على الرغم من إمكانية تطبيق هذه التقنية لإيصال DNA أو RNA مزدوج السلسلة أو أي جزيء آخر يمكن تحميله على جزيئات الذهب المجهرية، إلا أننا سنستخدمها لعمليتي التثبيط (knockdown) والإدراج (knockin) لجزيء توجيه المحاور العصبية Rin. مرحباً، أنا من مختبر Eduardo Ano في قسم العلوم البيولوجية بجامعة كاليفورنيا سان دييغو. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتثبيط أو تحفيز تعبير جزيء توجيه المحاور العصبية networking، الذي يتم التعبير عنه طبيعياً في الجدار البطني للجسم، ولكن ليس في النطاق الظهري لجميع قطع جسم العلقة.

سنقوم بإيصال جزيئات من الـ RNA مزدوج السلسلة أو الـ plasmid DNA إلى جدار الجسم والعقد العصبية في قطع مختارة خلال المراحل المبكرة من النمو. ويُعد الإيصال الشمولي بواسطة مسدس الشعيرات الهوائي (pneumatic capillary gun) مهماً بشكل خاص لأنه يتيح إحداث اضطراب في أنماط التعبير الجيني في مناطق محددة من القطعة الفرعية، مع ترك القطع غير المعالجة كعناصر تحكم داخلية. علاوة على ذلك، يمكن استخدامه للوصول إلى طبقات الخلايا الداخلية في المراحل المبكرة من النمو دون إلحاق ضرر بالأنسجة ودون الحاجة إلى فتح العينة.

وأخيرًا، يتميز التوصيل الشمولي بميزة القدرة على استهداف عدد محدود من الخلايا في موقع محدد، وهو وضع متوسط بين تعطيل الجينات في خلية واحدة عن طريق الحقن المجهري والتعطيل الجهازي من خلال النهج الجينية. لذا، دعونا نبدأ. لقد استُخدمت دودة LE الطبية لفترة طويلة لدراسة خصائص الخلايا العصبية والدوائر العصبية المرتبطة سلوكيًا بسبب بساطة الجهاز العصبي المركزي، الذي يتكون من حوالي 200 زوج ثنائي من العصبونات ومجموعة صغيرة من الدبقيات العملاقة.

يمكن تحديد كل عقدة عصبية قطعية في القطع الجسمانية الـ 21، وكل عصبون في العلقة، ودراستها بشكل متكرر من عينة إلى أخرى، بدءاً من الجنين المبكر وصولاً إلى البالغ الأكبر سناً. ومنذ عصر الفراعنة، استُخدمت العلقة لأغراض الفصادة، كما أن استخدامها المستمر في الطب يجعلها متاحة بسهولة من موردي الحيوانات التجاريين. ومع ذلك، وبما أننا ندرس تطور الجهاز العصبي، فإننا نحتفظ بمستعمرة حية من العلق يبلغ عددها عدة مئات في مختبرنا، مما يوفر لنا إمداداً ثابتاً من الأجنة لتجاربنا.

تعتبر العلقات خنثوية، حيث تمتلك تراكيب أنثوية وذكرية وتقوم بالتلقيح الخلطي. وبناءً على ذلك، فإن جميع العينات قادرة على وضع البيض.

يقومون بذلك داخل بنية تسمى الشرنقة، والتي يصنعونها بأنفسهم باستخدام مجموعة من الغدد الخاصة التي تفرز بوليمرات مثيرة للاهتمام في منطقة من الجسم تُعرف باسم الـ C clay tellum. وعندما تصبح العلقة جاهزة لوضع البيض، تحفر لنفسها داخل الطحالب، التي نوفرها في الأحواض، وتبدأ في تشكيل هذه الشرنقة البيضاوية الشكل حول جسدها؛ وبمجرد إفراز كمية كافية من المواد وبدء بلمرة الجزيئات، تضع العلقة البيض، بالإضافة إلى مح يغذي داخل الشرنقة، ثم تتملص خارجاً. وباستخدام شفرة حلاقة، يمكننا إزالة الأجنة عن طريق قطع فتحة في نهاية الشرنقة.

بشكل عام، تحتوي كل شرنقة على 10 إلى 20 جنينًا اعتبارًا من اليوم السادس تقريبًا بعد بدء تمايزها. ويمكن إخراج الأجنة من الشرنقة وتربيتها في مياه البرك. وفي هذه المراحل نبدأ عادةً دراساتنا التجريبية حول التطور العصبي.

تتمثل الخطوة الرئيسية الأولى في هذا الإجراء في تحضير الجسيمات المغلفة. سنعرض في هذا العرض التوضيحي كيفية إيصال جسيمات ذهبية مغلفة بجزيئات RNA مزدوجة السلاسل من نظير lech لجزيء توجيه المحور العصبي rin إلى أجنة lech. الخلايا المستهدفة هي خلايا العضلات الطولية البطنية في جدار الجسم، والمعروف عنها أنها تعبر عن Rin وتطلقه بدءاً من المراحل المبكرة في Agenesis.

هدفنا هو تثبيط التعبير الطبيعي في قطعة جسم واحدة في أبكر وقت ممكن خلال النمو، ومراقبة كيفية تأثير ذلك على تصنيفات العصبونات الحساسة لهذا العامل النمائي الهام. لهذه الخطوة، نحتاج إلى حمام الموجات فوق الصوتية، وجهاز الفورتكس، وجهاز طرد مركزي مكتبي، ودلو ثلج. كما نحتاج أيضاً إلى isopropanol بتركيز 100%، والذي يجب وضعه على الثلج قبل الاستخدام.

ابدأ بـ 100 µL من محلول الربط المنظم الذي يحتوي على 50 mg من جزيئات vault لكل mL. صُممت هذه الجزيئات لتقنية RNAi وهي مُصنعة من قبل شركة chell. بعد ذلك، قم بتخفيف محلول الجزيئات بإضافة 100 µL من محلول الربط المنظم، ثم استخدم جهاز الـ vortex لفترة وجيزة، وعالج المحلول بالموجات فوق الصوتية (sonicate) لمدة دقيقة إلى دقيقتين لفصل الجزيئات التي قد تكون تكتلت معاً.

بعد دقيقتين من الدمج، أضف من 5 إلى 10 µg من الـ double stranded RNA إلى الجسيمات، ثم استخدم جهاز الـ vortex واترك الخليط في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين. بعد انتهاء الدقيقتين، قم بطرد مركبات الـ double stranded RNA والجسيمات مركزياً بسرعة لا تقل عن 2,500 RPM في جهاز الـ micro fuge لمدة 15 ثانية تقريباً.

للحصول على الراسب، قم بإزالة السائل الطافي وإضافة 750 µL من الإيزوبروبانول مع تقليل إزعاج الكتلة المترسبة قدر الإمكان. قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي دقيق (microfuge) وأزل السائل الطافي بعد عملية الطرد، ثم قم بتعليق جزيئات الذهب في إيزوبروبانول بارد بتركيز 100% عن طريق السونكة (sonication). وباختصار، يتم تطبيق نبضتين إلى ثلاث نبضات في جهاز السونكة لفصل الجزيئات.

اسكب المحلول على شريحة زجاجية واترك المذيب يتبخر تماماً. يتم الحصول على أفضل النتائج عندما تُغلف الجسيمات مباشرة قبل نقلها إلى النسيج، وهو ما سنوضح لكم كيفية القيام به في الخطوة التالية. قبل إجراء عملية transfection الإستية، دعونا نلقي نظرة على الإعداد التجريبي وكيفية تحضيره.

يتم تركيب مسدس الشعيريات الهوائي على مجهر دقيق لضمان توصيل الجسيمات بدقة إلى الأجنة. ويتم تصوير سطح الجنين باستخدام مجهر فيديو. كما يقوم ليزر أشباه الموصلات بتوليد شعاع ضوئي يوجه عبر الشعيرة الداخلية للمسدس ويستخدم للتصويب نحو النسيج المستهدف.

توفر خطوط منفصلة من أنابيب Titan المتصلة بالمداخل الثلاثة لرأس المسدس غاز الهيليوم المضغوط من مصدر واحد. يكون أحد الخطوط مفتوحاً باستمرار، مما يخلق تدفقاً متواصلاً من غاز الهيليوم عبر المسدس. أما الخطان الآخران فيكونان مغلقين عادةً بواسطة الصمام الملفي (solenoid valve)، ويحتويان على جسيمات ذهبية بطبقتين مختلفتين من التغليف تم تحميلهما مسبقاً في الأنابيب.

على هيئة مسحوق جاف. يتم توصيل الأنبوب الشعري الخارجي للمسدس بنظام تفريغ بضغط مقياس يبلغ 12.5- PSI. ويتم تغيير ضغط الرأس لـ hi بين 10 و15 PSI لضبط عمق اختراق الجسيمات المطلوب.

يمكن لضغط رأس الهيليوم أن يؤثر بشكل كبير على عمق اختراق الجزيئات، وكذلك المسافة من الجنين إلى المسدس. ومن المهم اختيار قطر الفوهة، الذي يختلف بين مسدسات الجينات المختلفة، بما يتناسب مع المنطقة المستهدفة. والآن وبعد أن عرضنا إعدادنا التجريبي، دعونا نجهز مسدس الجينات ونقوم بحقن بعض أجنة العلق.

قبل تحميل أنابيب Titan، من الضروري أن تكون جزيئات الذهب المغلفة جافة تماماً. يتم أولاً كشط جزيئات الذهب المغلفة من الشرائح الزجاجية باستخدام شريحة غطاء أو شفرة حلاقة لتصبح جاهزة للتحميل في قطعة مطوية من ورق الـ whey. يجب ثني الأنبوب على شكل حرف U بالقرب من الموصل بحيث لا تنتشر الجزيئات على طول الأنبوب أثناء تحميلها، بل تتركز بالقرب من الموصل.

التقط الجسيمات باستخدام ملعقة صغيرة أو قطعة من ورق الوزن على شكل حرف V وقم بتعبئة الأنبوب. قم بالنقر على الأنبوب بإصبعك أثناء خطوة التعبئة لتوزيع الجسيمات بالتساوي. بعد تعبئة الأنبوب، يمكننا الآن الانتقال إلى إيصال الـ double stranded RNA باستخدام مسدس الجينز (Jing gun)، ولكن ليس قبل أن نقوم بتجهيز العلقات.

يمكنكم هنا رؤية أجنة العلق، والتي يبلغ عمرها 10 أيام تقريباً. وهي موجودة الآن في وسط معقم سيتم الاحتفاظ بها فيه قبل وبعد إيصال الـ double stranded RNA. وتتمثل الخطوة الأولى في تحضير الأجنة التجريبية لإيصال الـ double stranded RNA في إضافة محلول من 8%ethanol في وسط معقم إلى قطعة مسطحة من السيليكون المرن تحتوي على أخدود على شكل حرف V.

تتم إضافة جنين واحد ووضعه بحيث يكون الجانب البطني للأعلى مباشرة قبل إطلاق الجسيمات. يتم خفض مستوى الوسط في الغرفة ليكون أسفل السطح العلوي للجنين مباشرة، وتوضع قطعة من الورق النسيجي بها ثقب صغير مقصوص في المنتصف فوق الجنين لتثبيته ومنع جفاف سطحه، وفي الوقت ذاته للكشف فقط عن المنطقة التي سيتم استهدافها في المرحلة الجنينية التي نستخدمها اليوم. في المرحلة E 10، يمكن تحديد موقع خلايا العضلات الطولية على بعد حوالي 10 إلى 20 µm من السطح الخارجي، داخلياً بالنسبة للبشرة والأدمة والعضلات الدائرية.

على عكس الخلايا العضلية، تقع العقد المركزية على الجانب البطني للأجنة في المراحل الجنينية التي نعمل عليها من E 7 إلى E 12 على عمق حوالي 50 µm داخل السطح البطني للجسم. سنقوم بضبط ضغط الهيليوم بحيث نستهدف العضلات الطولية، التي يمكن العثور عليها في عمق أكثر سطحية من العقد. الآن نحن مستعدون لقذف العضلات الطولية بجسيمات الذهب.

يمكن عادةً استخدام حمولة من جزيئات الذهب تزن حوالي نصف مليجرام لما يصل إلى 10 طلقات، حيث تسلم الطلقة الواحدة عادةً بضع مئات من الجزيئات. يتم توليد الطلقة عن طريق فتح أحد الصمامات لفترة وجيزة لمدة 0.3 ثانية، مما يؤدي إلى حقن كتلة من الجزيئات من خط الأنابيب المقابل إلى تجويف المسدس. ولتغطية منطقة الأنسجة المستهدفة، غالباً ما تكون هناك حاجة إلى إطلاق طلقات متعددة.

يتم النقر بلطف على الأنابيب بين كل عملية حقن لإزاحة بعض الجسيمات وتسهيل حقنها في تيار الهيليوم المستمر داخل فوهة المسدس. إذا كنت ترغب في إيصال كاشف ثانٍ في نفس المقايسة، يمكنك تحميل جسيمات بديلة في أنبوب ثانٍ مباشرة بعد إيصال جسيمات الذهب. تُعاد الأجنة إلى مياه البركة الاصطناعية، ويفضل وضع جنين واحد في كل طبق لمدة تتراوح من يوم إلى ثلاثة أيام حتى يُعتبر تداخل RNAi أو التعبير المنتبذ كافياً.

خلال هذه الفترة، يتم الاحتفاظ بالأجنة في غرفة مظلمة في درجة حرارة الغرفة. إليكم نظرة على مقايسة التهجين الموضعي لبروتين narine، عند تثبيط Mr.NA. يمكنكم ملاحظة أن عدداً قليلاً من الخلايا العضلية في الجنين المعالج لا تعبر عن terrin.

تحتوي هذه العضلات على جسيمات. يمكنك ملاحظة أنه عندما تم تغليف الجسيمات بـ RNA مزدوج الشريط لـ terrin، فقد تسببت في تثبيط واضح للتعبير عن narin، وهو ما حدث فقط في الخلايا التي تحتوي على جسيمات، وعادة ما يكون هناك جسيم واحد إلى جسيمين لكل خلية. وعندما تقوم بتغليف الجسيمات بـ plasmid يشفر GFP، فإنك تحصل على فلورة في الخلايا العصبية عندما تستقر في نوياتها باستخدام مسدس الشعيرات الهوائي الذي نستخدمه.

تمكنا في هذا العرض التوضيحي من إيصال كلا الجسيمين إلى الخلايا في حجم موضعي صغير من جنين حي دون التسبب في تلف ملموس للخلايا في المنطقة المستهدفة. كما أوضحنا لكم كيف يمنح مسدس الشعيرات الدموية المتنقل تقنية الإيصال الشمولي وقدرة جديدة على إدراج الجينات (knock in) وتعطيلها (knock down) في منطقة مجهرية من نسيج محصور في ثلاثة أبعاد ومستهدف بدقة عالية دون إلحاق تلف ملموس بالنسيج. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، مع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.