طرق القياس الميداني لشكل الميتوكوندريا في خلايا العضلات والشوان الطرفية للفئران
أبريل 10, 2026
حقن موضعية لصبغة ميتوكوندريا نهاية ميتوكوندريا خلية شوان في الجسم الحي للمجهر الكونفوكلي. تستخدم هذه الطريقة إثبات المفهوم الذي تم إثباته في أنسجة العضلات الهيكلية من فئران ذات عضلات سليمة أو مريضة لتوفير تصور ميتوكوندريا بدقة عالية.
تبحث أبحاثنا في شكل الخلايا الميتوكوندرية لخلايا شوان النهائية عند الوصلة العصبية العضلية لأول مرة. يمكننا نهجنا من قياس شكل الميتوكوندريا في الأنسجة التي يصعب الحصول عليها، مثل الأسرة الشعرية واللمفاوية. للبدء، احصل على نوع البرية وفأرة D2-mdx.
بعد التأكد من عمق التخدير عبر رد فعل القرص على إصبع القدم، أدخل الإبرة عند الوتر البعيد باتجاه الركبة اليمنى. حقن 50 ميكرولتر من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الحمراء البعيدة ذات الميكرومولين على عضلة الظنبوب، أو عضلة TA، أثناء سحب الإبرة على طول مسار الحقن، وحضن الصبغة في الجسم الحي لمدة ساعة. أثناء إبقاء الحيوان تحت التخدير، استخدم المقص والملاقط لتشريح وعزل عضلة TA قبل القتل الرحيم.
ضع عضلة TA المعزولة في 4٪ بارافورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم، تحت المجهر المجسم، افصل الألياف بلطف عن طريق الإغراء. أضف صبغة حمض نووي مثقل للخلايا إلى 4٪ بارافورمالديهايد للحصول على تركيز نهائي من خمسة إلى 10 ميكروغرامات لكل ملليلتر لوضع العلامات النووية.
ثم اغسل عضلة TA ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة الصبغة الزائدة. جفف العضلة بشكل متسلسل بنسبة 50٪ 75٪ و100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق لكل منهما. ثم حضن العينة بشكل متسلسل في محاليل تنظيف الأنسجة واحد واثنان لمدة 30 دقيقة لكل منهما، مع التأكد من غمرها بالكامل.
ضع العضلة على غطاء الدرجات. استخدم كتلة زجاجية بحجم 2.5 × 2 في 1 سنتيمتر تزن 7.8 جرام لتسويتها بلطف. احصل على فأرة بيتا S100.
بعد تأكيد عمق التخدير عبر رد فعل الضغط على إصبع القدم، قم بعمل شق جلدي صغير فوق عضلة الألوية الكبرى (GM). حقن 75 ميكرولتر من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الحمراء البعيدة ذات الميكرومولرين تحت عضلة التعديل الوراثي. أغلق الجرح ودع الصبغة تحضن لمدة 45 دقيقة لتحديد خلايا شوان النهائية بشكل انتقائي.
أثناء التخدير بحيوان، قم بتشريح عضلة التعديل وراثيا خلال 10 دقائق، وضعها فورا في محلول ملحي بارد بمعدل 0.9٪. فقط إذا استخدمت فئران D2-mdx، أضف صبغة مستقبلات الأستيل كولين الفلورية عند تخفيف من 1 إلى 500 إلى حوض التشريح الدقيقي، وحضن الأنسجة لمدة 30 دقيقة. قم بقص الدهون الزائدة والأنسجة الضامة، وانقل عضلة GM إلى غطاء مع توجيه الجانب البطني للأسفل للمجهر المقلوب.
أضف ميكرولترين من وسط التثبيت العام على السطح الظهري للجهاز الطبي الكامل، وفرد النسيج باستخدام كتلة زجاجية قبل التصوير. في البرنامج، اضبط طول موجة الإثارة إلى 646 نانومتر. بعد إضافة قطرتين من محلول التنظيف الثاني، اختر عدسة 63X الشيئية لتصوير عضلة TA، واضبط عمق المكدس Z بالقرب من 100 ميكرومتر.
ثم اختر وضع فك الالتفاف، وطبق معلمات محسنة للنظام. اضبط حجم الخطوة إلى ميكرومتر واحد واحصل على صور. للحصول على صور خلايا شوان الطرفية، اختر عدسة الهدف بتكبير 20 مرة، وضبط عمق المكدس Z إلى حوالي 17 ميكرومتر، والتقاط الصور.
بعد ذلك، اختر عدسة الهدف بتكبير 63 مرة واحصل على صور لخلايا شوان الطرفية الفردية. استيراد شرائح Z الفردية لتدريب البرنامج على التعرف على إشارة الميتوكوندريا. وإجراء تحليل كمي باستخدام برامج مدعومة بالذكاء الاصطناعي.
طور أقنعة الصور لمراجعة المحققين. يتم فصل تكدسات الصور ثلاثية الأبعاد إلى أقسام بصرية فردية وفقا لتحسين الخوارزميات. اختر كل شريحة Z خامسة من كل صورة ثلاثية الأبعاد، واحسب المتوسط لكل عينة.
توحيد معلمات التصوير عبر جميع العينات، وقياس شكل الميتوكوندريا. إجراء تحليل الكيمياء المناعية والتحليل الإحصائي لتقييم فروق المجموعة والارتباطات. انخفض الاتصال الميتوكوندري في عضلة mdx مقارنة بالفئران البرية.
لوحظ عدد أكبر من شظايا الميتوكوندريا الصغيرة وعدد أقل من الشبكات الميتوكوندرية الكبيرة المترابطة في فئران mdx. في الفئران البرية، أظهرت الميتوكوندريا في خلايا شوان النهائية هياكل حلقية مترابطة بالقرب من التفرعات. على النقيض من ذلك، في فئران mdx، بدت الميتوكوندريا مجزأة وتفتقر إلى تشكيلات حلقية بالقرب من التفرعات.
أكد المجهر الكونفوكالي والإلكتروني هياكل ميتوكوندرية على شكل دونات مماثلة في خلايا شوان الطرفية. أظهر التحليل بعد المشبك أن الميتوكوندريا تحت الساركولية تتجمع حول مستقبلات الأستيل كولين، تفتقر إلى البنية المميزة الشبيهة بالبريتزل. كشف تحليل الصور أن ميتوكوندريا خلايا شوان النهائية في عضلة mdx أظهرت زيادة في المساحة والتجزئة مقارنة بعضلات النوع البري، دون اختلاف في حجم الجسيمات النسبية.
أظهرت قياسات قوة العضلات انخفاضا في التشنجات مع تباين أكبر وانخفاض في القوة القصوى في عضلات MDX. كما انخفض إنتاج القوة عبر ترددات التحفيز المتزايدة بشكل ملحوظ في عضلات MDX. أظهرت عضلة MDX انزياحا يسارا في حجم الألياف، مما يشير إلى أن ألياف العضلة أصغر بحوالي 60٪ مقارنة بالنوع البري.
يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة وقياس شكل الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية وخلايا شوان الطرفية. يمكن للدراسات المستقبلية تكييف هذا النهج لدراسة شكل الميتوكوندريا في الدورة الدموية الدقيقة والأوعية اللمفاوية.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This protocol presents a reproducible method for labeling and quantifying three-dimensional mitochondrial network morphology in whole-mount skeletal muscle and terminal Schwann cells (tSCs) in mice. Utilizing in vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye and standard confocal microscopy, the approach enables detailed analysis of mitochondrial architecture within intact neuromuscular tissues, overcoming challenges associated with tissue disruption and anatomical complexity.
Key Study Components
Area of Science
- Cellular and molecular neuroscience
- Muscle biology
- Imaging and microscopy
Background
- Mitochondrial network morphology is a key indicator of cellular health.
- Quantifying mitochondrial architecture in intact tissues is technically challenging.
- Terminal Schwann cells (tSCs) are critical for neuromuscular junction maintenance and regeneration.
- tSCs are difficult to analyze in situ due to their location and sensitivity to tissue disruption.
Purpose of Study
- To develop a reproducible protocol for labeling and quantifying mitochondrial morphology in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- To enable analysis of mitochondrial networks in situ without the need for transgenic reporters or specialized imaging platforms.
- To validate the method in both healthy and dystrophic muscle tissue.
Methods Used
- In vivo delivery of a membrane potential–sensitive mitochondrial dye.
- Rapid tissue processing to preserve mitochondrial structure.
- High-resolution confocal microscopy for three-dimensional imaging.
- Image stack analysis to quantify mitochondrial network connectivity, area, and fragmentation.
Main Results
- The protocol successfully labels and quantifies mitochondrial networks in whole-mount skeletal muscle and tSCs.
- Validation in dystrophic and healthy muscle confirms expected differences in mitochondrial morphology.
- The method is adaptable to tSCs using S100β reporter mice.
- Analysis can be performed using equipment commonly available in university core facilities.
Conclusions
- This approach enables detailed analysis of mitochondrial morphology in intact neuromuscular tissues.
- It eliminates the need for transgenic mitochondrial reporters or specialized imaging platforms.
- The protocol is adaptable to other thin or superficially accessible tissues.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative in situ analysis of mitochondrial morphology in muscle and terminal Schwann cells addresses a critical gap in early discovery and target validation for neuromuscular and metabolic disease research. This protocol enables high-content, reproducible assessment of mitochondrial network integrity within intact tissues, supporting predictive confidence in disease-relevant models and facilitating risk-adjusted portfolio decisions. Its compatibility with standard imaging infrastructure enhances accessibility and scalability across R&D teams.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of mitochondrial network health in physiologically relevant tissue environments.
- Supports functional target validation by quantifying network connectivity, area, and fragmentation in disease and control models.
- Facilitates mechanistic de-risking by distinguishing mitochondrial phenotypes in healthy versus dystrophic muscle.
- Provides quantitative endpoints for hypothesis-driven pathway analysis.
Screening & Assay Development
- Establishes validated imaging and quantification workflows for mitochondrial morphology in whole-mount tissues.
- Delivers reproducible, quantitative outputs suitable for assay standardization and cross-study comparison.
- Enables screening of interventions affecting mitochondrial dynamics in accessible tissue systems.
- Supports platform reuse across multiple tissue types without reliance on transgenic reporters.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mitochondrial morphology endpoints with disease-relevant tissue contexts for translational biomarker development.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by enabling analysis in both muscle and Schwann cells.
- Provides risk-adjusted data to inform advancement of mitochondrial-targeted therapeutics.
- Facilitates adaptation to additional thin or superficially accessible tissues for broader translational impact.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling robust mitochondrial morphology quantification in intact tissues, supporting both early target validation and downstream translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and mechanistic de-risking through direct measurement of mitochondrial network features.
- Screening: Provides standardized, quantitative imaging outputs for assay development and compound evaluation.
- Analytics: Delivers network connectivity, area, and fragmentation metrics for comparative analysis across experimental conditions.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical phases by enabling biomarker alignment in disease-relevant tissues.
- Enterprise Reuse: Offers a broadly adaptable workflow compatible with standard confocal microscopy platforms.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in mitochondrial research.
- Operational Value: Promotes reproducibility and scalability using widely available imaging infrastructure.
- Strategic Value: Enhances go/no-go decision-making and capital efficiency by providing robust, quantitative endpoints.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of mitochondrial-targeted programs across disease areas.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy and quantitative image analysis.
- Utilizes standard membrane potential–sensitive dyes and imaging platforms common to core facilities.
- Demands cross-team standardization of tissue processing and imaging protocols for reproducibility.
- Adaptable to other thin or superficially accessible tissues with minimal protocol modification.
- Dependent on tissue accessibility and dye compatibility for optimal results.
