طرق القياس الميداني لشكل الميتوكوندريا في خلايا العضلات والشوان الطرفية للفئران

تبحث أبحاثنا في شكل الخلايا الميتوكوندرية لخلايا شوان النهائية عند الوصلة العصبية العضلية لأول مرة. يمكننا نهجنا من قياس شكل الميتوكوندريا في الأنسجة التي يصعب الحصول عليها، مثل الأسرة الشعرية واللمفاوية. للبدء، احصل على نوع البرية وفأرة D2-mdx.

بعد التأكد من عمق التخدير عبر رد فعل القرص على إصبع القدم، أدخل الإبرة عند الوتر البعيد باتجاه الركبة اليمنى. حقن 50 ميكرولتر من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الحمراء البعيدة ذات الميكرومولين على عضلة الظنبوب، أو عضلة TA، أثناء سحب الإبرة على طول مسار الحقن، وحضن الصبغة في الجسم الحي لمدة ساعة. أثناء إبقاء الحيوان تحت التخدير، استخدم المقص والملاقط لتشريح وعزل عضلة TA قبل القتل الرحيم.

ضع عضلة TA المعزولة في 4٪ بارافورمالديهايد في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة. ثم، تحت المجهر المجسم، افصل الألياف بلطف عن طريق الإغراء. أضف صبغة حمض نووي مثقل للخلايا إلى 4٪ بارافورمالديهايد للحصول على تركيز نهائي من خمسة إلى 10 ميكروغرامات لكل ملليلتر لوضع العلامات النووية.

ثم اغسل عضلة TA ثلاث مرات في PBS لمدة خمس دقائق لكل منها لإزالة الصبغة الزائدة. جفف العضلة بشكل متسلسل بنسبة 50٪ 75٪ و100٪ إيثانول لمدة خمس دقائق لكل منهما. ثم حضن العينة بشكل متسلسل في محاليل تنظيف الأنسجة واحد واثنان لمدة 30 دقيقة لكل منهما، مع التأكد من غمرها بالكامل.

ضع العضلة على غطاء الدرجات. استخدم كتلة زجاجية بحجم 2.5 × 2 في 1 سنتيمتر تزن 7.8 جرام لتسويتها بلطف. احصل على فأرة بيتا S100.

بعد تأكيد عمق التخدير عبر رد فعل الضغط على إصبع القدم، قم بعمل شق جلدي صغير فوق عضلة الألوية الكبرى (GM). حقن 75 ميكرولتر من صبغة الميتوكوندريا الفلورية الحمراء البعيدة ذات الميكرومولرين تحت عضلة التعديل الوراثي. أغلق الجرح ودع الصبغة تحضن لمدة 45 دقيقة لتحديد خلايا شوان النهائية بشكل انتقائي.

أثناء التخدير بحيوان، قم بتشريح عضلة التعديل وراثيا خلال 10 دقائق، وضعها فورا في محلول ملحي بارد بمعدل 0.9٪. فقط إذا استخدمت فئران D2-mdx، أضف صبغة مستقبلات الأستيل كولين الفلورية عند تخفيف من 1 إلى 500 إلى حوض التشريح الدقيقي، وحضن الأنسجة لمدة 30 دقيقة. قم بقص الدهون الزائدة والأنسجة الضامة، وانقل عضلة GM إلى غطاء مع توجيه الجانب البطني للأسفل للمجهر المقلوب.

أضف ميكرولترين من وسط التثبيت العام على السطح الظهري للجهاز الطبي الكامل، وفرد النسيج باستخدام كتلة زجاجية قبل التصوير. في البرنامج، اضبط طول موجة الإثارة إلى 646 نانومتر. بعد إضافة قطرتين من محلول التنظيف الثاني، اختر عدسة 63X الشيئية لتصوير عضلة TA، واضبط عمق المكدس Z بالقرب من 100 ميكرومتر.

ثم اختر وضع فك الالتفاف، وطبق معلمات محسنة للنظام. اضبط حجم الخطوة إلى ميكرومتر واحد واحصل على صور. للحصول على صور خلايا شوان الطرفية، اختر عدسة الهدف بتكبير 20 مرة، وضبط عمق المكدس Z إلى حوالي 17 ميكرومتر، والتقاط الصور.

بعد ذلك، اختر عدسة الهدف بتكبير 63 مرة واحصل على صور لخلايا شوان الطرفية الفردية. استيراد شرائح Z الفردية لتدريب البرنامج على التعرف على إشارة الميتوكوندريا. وإجراء تحليل كمي باستخدام برامج مدعومة بالذكاء الاصطناعي.

طور أقنعة الصور لمراجعة المحققين. يتم فصل تكدسات الصور ثلاثية الأبعاد إلى أقسام بصرية فردية وفقا لتحسين الخوارزميات. اختر كل شريحة Z خامسة من كل صورة ثلاثية الأبعاد، واحسب المتوسط لكل عينة.

توحيد معلمات التصوير عبر جميع العينات، وقياس شكل الميتوكوندريا. إجراء تحليل الكيمياء المناعية والتحليل الإحصائي لتقييم فروق المجموعة والارتباطات. انخفض الاتصال الميتوكوندري في عضلة mdx مقارنة بالفئران البرية.

لوحظ عدد أكبر من شظايا الميتوكوندريا الصغيرة وعدد أقل من الشبكات الميتوكوندرية الكبيرة المترابطة في فئران mdx. في الفئران البرية، أظهرت الميتوكوندريا في خلايا شوان النهائية هياكل حلقية مترابطة بالقرب من التفرعات. على النقيض من ذلك، في فئران mdx، بدت الميتوكوندريا مجزأة وتفتقر إلى تشكيلات حلقية بالقرب من التفرعات.

أكد المجهر الكونفوكالي والإلكتروني هياكل ميتوكوندرية على شكل دونات مماثلة في خلايا شوان الطرفية. أظهر التحليل بعد المشبك أن الميتوكوندريا تحت الساركولية تتجمع حول مستقبلات الأستيل كولين، تفتقر إلى البنية المميزة الشبيهة بالبريتزل. كشف تحليل الصور أن ميتوكوندريا خلايا شوان النهائية في عضلة mdx أظهرت زيادة في المساحة والتجزئة مقارنة بعضلات النوع البري، دون اختلاف في حجم الجسيمات النسبية.

أظهرت قياسات قوة العضلات انخفاضا في التشنجات مع تباين أكبر وانخفاض في القوة القصوى في عضلات MDX. كما انخفض إنتاج القوة عبر ترددات التحفيز المتزايدة بشكل ملحوظ في عضلات MDX. أظهرت عضلة MDX انزياحا يسارا في حجم الألياف، مما يشير إلى أن ألياف العضلة أصغر بحوالي 60٪ مقارنة بالنوع البري.

يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة وقياس شكل الميتوكوندريا في العضلات الهيكلية وخلايا شوان الطرفية. يمكن للدراسات المستقبلية تكييف هذا النهج لدراسة شكل الميتوكوندريا في الدورة الدموية الدقيقة والأوعية اللمفاوية.