نموذج ما قبل السريري لالتهاب العزل الزليلي باستخدام نسيج سيلاني بشري خارج الجسم الحي مع وظيفة وبنية محفوظة

الأسئلة الرئيسية التي نريد الإجابة عليها هي ما هو الاستجابة المناعية المخاطية الطبيعية للمنبهات المعدية والالتهابية، وكيف ينعكس ذلك في التعديلات على بنية المخاط؟ تركيزي السريري والبحثي الرئيسي هو على علاج المرضى المصابين بالسمنة المرضية الذين يعانون من التهاب المفاصل الروماتويدي في المرحلة النهائية. في كثير من الأحيان، يتم إهمالهم طبيا نظرا لصعوبتهم في العثور على خيارات العلاج الجراحي لمرضهم.

للبدء، قم بإجراء فتح المفاصل والتشريح في غرفة العمليات. استخدم نهجًا طبيًا قياسيًا للجانب الأنسي من الرضفة وقم بإجراء كشف أكبر عند إجراء عملية جراحية لمريض يعاني من السمنة المرضية والتهاب المفاصل في المرحلة النهائية. حدد المخاط الأمامي واستخدم الإلكتروكوتيرية لتشريح الأنسجة.

لاحظ الركبة بحثًا عن علامات الالتهاب، حيث قد يظهر المرضى المصابون بالسمنة استجابة التهابية محلية ترتبط مع الآثار الالتهابية الأوسع للسمنة. قم بتمرير المخاط إلى عضو فريق البحث بطريقة معقمة. ضع حاوية العينات المملوءة بـ Dulbecco's PBS أو DPBS البارد على الثلج ونقل الأنسجة المخاطية الأمامية البشرية المكتسبة أثناء جراحة استبدال الركبة الكلي إلى الحاوية.

اغسل الأنسجة مرتين في DPBS البارد لمدة 10 دقائق على هزاز اللوحة. ثم قم بنقل المخاط إلى طبق بتري معقم بقطر 10 سم أو أكبر تحت خزانة السلامة الحيوية من المستوى 2. أضف DMEM منخفض الجلوكوز معقمًا وباردًا يحتوي على بيروفات الصوديوم وL-جلوتامين لملء الطبق حتى نصفه.

حدد البطانة المخاطية من خلال طبقة داخلية لؤلؤية دون تقشيرها. قم بترتيب الأدوات المطلوبة للحصول على عينات حيوية بقطر ثلاثة ملليمترات على الأقل لتكرار تقنيتين. باستخدام مقص القزحية أو مشرط، قم بفصل الأنسجة الدهنية والأنسجة اللحمية الزائدة من الجانب المحروق لعزل المخاط، مع الحفاظ على عمق الأنسجة بحوالي أربعة إلى خمسة ملليمترات طوال العملية.

غيّر وسط طبق بتري حسب الضرورة للحفاظ على مجال الرؤية. قم بوضع الأنسجة مع البطانة المخاطية مواجهةً لأداة القطع. قم بتثبيت الأنسجة باليد غير المهيمنة باستخدام الملاقط أو المشابك، وقم بقطع الأنسجة بتطبيق ضغط عمودي ثابت مع تقلبات لطيفة.

قم باستبدال أداة القطع بعد حوالي 10 إلى 15 استخدامًا، أو عندما ينقلب الأنسجة أثناء القطع لتجنب إتلاف بنية البطانة الداخلية. افتح طبق بتري ثانٍ واملأه بخمسة إلى عشرة مليلترات من الوسط يحتوي على 10٪ FBS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. باستخدام ملقط مسطح أو غير مسنن، قم بنقل العينات إلى الطبق وقم بتحريكها بلطف لمدة ثانية إلى ثانيتين لغسل الحطام دون الضغط عليها بإحكام.

لتحضير البئر السفلي لنظام تحليل مساحة المفاصل، أضف 600 ميكرولتر من DMEM منخفض الجلوكوز يحتوي على 10٪ FBS عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. أضف التحكم في المركب أو عامل العلاج المختار، مثل LPS أو MCP-1، إلى البئر السفلي. حدد حجم المسام العابرة بناءً على النتيجة التجريبية المرجوة، ثم أضف 300 ميكرولتر من DMEM منخفض الجلوكوز يحتوي على 10٪ FBS إلى العابر.

باستخدام الملقط المعقم، قم بنقل العينات الفردية بلطف إلى وسط العابر، مع تجنب العينات الرفيعة والمتطايرة. ثم قم بوضع التجميع في حاضنة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ من ثاني أكسيد الكربون لمدة ثماني إلى 72 ساعة اعتمادًا على الاختبارات النهائية التي سيتم إجراؤها. قم بتثبيت الأنسجة المخاطية في الفورمالين المحايد 10٪.

ثم قم بتضمينها وتقطيعها لتحليلها النسيجي. بعد التلوين باستخدام الهيماتوكسيلين واليوزين، قم بتصوير مقاطع الأنسجة عند 10X و40X باستخدام مجهر المجال المشرق. استخدم Photoshop لتحديد محيط البطانة الداخلية ومناطق البطينات في صورة TIFF عند 40X، مع حجب المناطق غير المستهدفة، كريات الدم الحمراء، والأوعية الدموية الكبيرة للتحليل الكمي اللاحق.

قم بتحليل الأقنعة النهائية لتحديد سماك البطانة الداخلية والبطينات، وسلامتها، ودرجة الخلوية. أخيرًا، قم بتقييم الخلايا المهاجرة بواسطة قياس التدفق الخلوي والعوامل الذائبة في الوسط المجمع بواسطة الفحص المناعي المرتبط بالإنزيم. أظهرت الأنسجة المخاطية التي تمت زراعتها بجرعات متزايدة من MCP-1 أو LPS تغييرات مميزة في مورفولوجيا البطانة الداخلية تشمل البطانة الداخلية الهشة وزيادة سماك البطانة الداخلية مع انخفاض كثافة الخلايا مقارنة بالتحكم.

أدى علاج MCP-1 وLPS إلى تغيير الاستجابة السيتوكينية للمخاط. أدى MCP-1 إلى التعبير عن علامة الخلايا الليفية المسببة للأمراض podoplanin في البطينات، بينما زاد LPS من podoplanin في كل من البطانة الداخلية والبطينات. تضمنت الخلايا المناعية المهاجرة في البئر السفلي العدلات، والخلايا القاتلة الطبيعية، وخلايا NKT، والخلايا التائية، والخلايا البائية، أو الخلايا المتغصنة، والوحيدات، أو الخلايا البلعمية، والخلايا البلعمية M2.

كانت الخلايا التائية هي أكثر الخلايا المناعية المهاجرة وفرة. من الناحية الإحصائية، لم يكن هناك فرق في هجرة الخلايا بناءً على التحفيز في البئر السفلي. تم اكتشاف الأوستيوبروتيجرين، وهو بروتين مرتبط بالتهاب المفاصل، في الأنسجة المخاطية المصابة بالتهاب المفاصل غير المعالجة عند 24 و48 و72 ساعة وكان أعلى بشكل ملحوظ عند 72 ساعة مقارنةً بـ 24 ساعة.

كان التعبير عن إنزيم أكسيد النيتريك القابل للحث في البطانة الداخلية مرتفعًا في الضوابط عند الصفر من الساعات وغائبًا تقريبًا بعد 24 ساعة. تم الحفاظ على التعبير عن إنزيم أكسيد النيتريك عند معالجته بN-acetyl cysteine. على العكس من ذلك، لم يغير N-acetyl cysteine تعبير إنزيم ماتريكس ميتالوبروتينايز-9، وهو علامة لكل من التهاب المخاط المحتمل والضرر المحتمل للغضروف.

يسمح هذا البروتوكول للباحثين بدراسة التعديلات في الطبقات المخاطية الداخلية والبطينات، بما في ذلك العمق، والخلوية، والسلامة، والتي تدل جميعها على الالتهاب. أهم الاعتبارات أثناء تنفيذ هذا البروتوكول هي الحصول على أنسجة حيوية قابلة للاستخدام من المتبرعين المناسبين، والعقم، وتحديد البطانة الداخلية للخزعة. ستقوم الدراسات المستقبلية بتقييم تحسين طول زراعة الأنسجة الحية لتقييم تجديد البطانة الداخلية للمخاط.