طريقة مبسطة لتحويل نبات نبات البالميفورا بواسطة البكتيريا الزراعية

يقدم هذا البروتوكول نظاما بسيطا وفعالا وقابلا للتكرار لتحويل نبات البالميفورا والكابسيسي الفيتوفثورا. للبدء، خذ صفيحة جديدة من مثقاب LB مع مضادات حيوية. أضف 20 ميكرولتر من وسط السائل LB إلى مركز اللوحة واسحب خلايا البكتيريا الزراعية من صفيحة نمت سابقا باستخدام أنبوب طرد مركزي دقيق معقم بسعة 1.5 ملليتر.

باستخدام قاعدة الأنبوب، انتشر الخلايا بشكل متساو عبر اللوحة. حضن الطبق طوال الليل عند درجة حرارة 28 درجة مئوية لمدة تتراوح بين 16 إلى 18 ساعة. بعد ذلك، قم بتنظيف خلايا البكتيريا الزراعية التي تنمو خلال الليل باستخدام رأس ماصة بسعة ملليلتر واحد.

أعد تعليق الخلايا في ملليلتر واحد من وسط تحفيز البكتيريا الزراعية عن طريق التوصيل بأنبوب للأعلى والأسفل. الآن، انقل الخلايا المعلقة إلى أنبوب معقم بسعة 50 ملليلتر مغطى بورق الألمنيوم وأضف وسط تحفيز البكتيريوم. قس الكثافة البصرية للعينة عند 600 نانومتر وتخفيفها بوسط تحفيز الأجروكتيريوم لتحقيق كثافة بصرية تبلغ 0.4.

ثم قم بفك غطاء الأنبوب المغطى بورق الألمنيوم الذي يحتوي على التعليق البكتيري. ضعه على هزاز منصة مع تحريك خفيف بسرعة تقارب 70 دورة في الدقيقة. أغمر صفيحة فيتوفثورا بالميفورا عمرها سبعة إلى ثمانية أيام بماء مبرد مسبقا إلى أربع درجات مئوية بسعة 10 ملليلتر.

استخدم رأس الماصة للنقر بلطف على السطح وإزالة أي فقاعات هواء على الوسط. حضن الطبق عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. ثم انقله إلى درجة حرارة الغرفة تحت الضوء لمدة 15 دقيقة أخرى.

باستخدام الماصة، يمكنك نقل حوالي سبعة إلى ثمانية ملليترات من الأبواغ الحيوانية المنبعثة بلطف إلى أنبوب طرد مركزي معقم بسعة 15 ملليتر دون إزعاج الميسيليوم والأبواغ. ثم انقل 20 ميكرولتر من نظام تعليق الزوسبور إلى أنبوب طرد مركزي دقيق بسعة 1.5 ملليتر، وأضف 180 ميكرولتر من الماء لتخفيف التعليق عشرة أضعاف. قم بدوامة الأنبوب لمدة دقيقة واحدة للإصرار على وجود الأبواغ الحيوانية واستخدم جهاز قياس الدم تحت المجهر لعد الأبواغ الحيوانية.

أضف خمسة ملليلتر من تعليق الزراعة النباتية المحضر إلى خمسة ملليتر من تعليق الزوسبور في أنبوب معقم مغطى بورق الألمنيوم بسعة 50 ملليتر. اخلط المحتويات بلطف، وقم بفك غطاء الأنبوب، واتركه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. خلال فترة الحضانة، حضر صفائح AZCA.

بمجرد أن يتصلب الوسط، ضع قطعة واحدة من غشاء Hybond-N+ المعقم على اللوح وأبق اللوح في الظلام. بعد ساعتين من الحضانة المشتركة، استخدم رأس الماصة لنشر 300 ميكرولتر من الخليط على غشاء Hybond-N+، لضمان خلو الحواف من السائل. اترك أطباق البترى مكشوفة في غطاء المحرك لمدة حوالي 10 دقائق حتى يجف الخليط في الهواء.

بمجرد توقف السائل عن الحركة على الغشاء، غط الصفائح. حضن الألواح المغطاة على درجة حرارة 25 درجة مئوية في الظلام لمدة يومين. بعد 48 ساعة من الحضانة، استخدم ملقط معقم لنقل غشاء Hybond-N+ مقلوبا على لوحة مثقاب بليش دون سحبه عبر سطح المثقب.

استخدم قاعدة أنبوب الطرد المركزي الدقيق بسعة 1.5 ملليلتر للضغط والانزلاق بلطف عبر سطح الغشاء لضمان الاتصال الكامل بالوسط. افحص الجزء السفلي من اللوحة بحثا عن فقاعات هواء واضغط عليها بلطف باستخدام نفس القاعدة المسطحة. حضن الصفيحة عند 25 درجة مئوية تحت دورة ضوء مدتها 12 ساعة و12 ساعة في الظلام لمدة يومين إلى ثلاثة.

وأخيرا، بعد يومين إلى ثلاثة أيام من الحضانة، قم بإزالة الغشاء باستخدام ملقط معقم واستمر في حضانة اللوح تحت نفس ظروف الضوء ودرجة الحرارة. أدى الحضانة المشتركة بين نباتات نباتية بالميفورا زوسبورات مع agrobacterium tumefaciens EHA 105 التي تعبر عن pCB301TOR-GFP عن مستعمرات مقاومة ل G418 على مثقاب Plich مدعومة ب 30 ميكروغرام لكل ملليلتر من G418، بينما لم تظهر مستعمرات على ألواح التحكم بدون عدوى البكتيريا. كان عدد المحولات المقاومة ل G418 لكل 10 إلى قوة سبعة أبواغ زوسوبوري 55 في التجربة الأولى و50 في التجربة الثانية.

أكد المجهر الفلوري وجود إشارة بروتينية فلورية خضراء واضحة في محولات الفيتوفثورا بالميفورا. بالإضافة إلى ذلك، تم تطبيق هذا البروتوكول على كابسيكي الفيتوفثورا لتوليد محولات تعبر عن GFP بنجاح. يتيح بروتوكولنا للباحثين دراسة وظائف الجينات، وتحديد موقع خلايا البروتين، وتتبع ديناميكيات عدوى الممرض.

قد تولد هذه البروتوكولات نسبة منخفضة من الإيجابيات الكاذبة، وبالتالي تتطلب طرقا إضافية لتأكيد المحولات الحقيقية. يمكن توسيع تطبيق هذا النظام التحويلي إلى فطريات وطقم فطريات أخرى. سنحاول أيضا تبسيط هذا البروتوكول أكثر في المستقبل.