منصة مبتكرة للتمدد والتصوير الخلوي في المختبر

كان هدفنا تطوير جهاز تمدد الخلايا منخفض التكلفة مستوحى من المجهر مستوحى من هوبرمان لدراسة كيفية تأثير التمدد الميكانيكي على وظيفة الخلية. يتيح هذا الجهاز للباحثين دراسة استجابات خلايا الحياة للمحفزات الميكانيكية، مقلدا الأنظمة الفسيولوجية مثل القلب النابض أو الرئتين التنفسيتين. للبدء عند الحاجة لمعدات الحماية الشخصية.

اخلط قاعدة سيلغارد 184 مع عامل التجفيف بنسبة 10 إلى واحد في طبق بلاستيكي. باستخدام مثبط اللسان، اخلط المكونات بقوة لمدة دقيقتين إلى ثلاث دقائق. ثم ضع الطبق في غرفة إزالة الغازات لمدة ساعة.

بعد ذلك، خذ القوالب المطبوعة ثلاثية الأبعاد المحضرة وأضف 1.3 جرام من خليط PDMS إلى القالب متساوي الاتجاه. ثم أضف 0.5 جرام من خليط PDMS إلى قالب المحور الأحادي. انشر الجل بشكل متساو على القالب وأزيل الغازات من القالب المملوء لمدة ساعة.

اترك الجل في القالب يستقر على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ثم أعالج العفن في الفرن عند 60 درجة مئوية طوال الليل. بعد ذلك، اخلط الجزئين A و B من جل NuSil 8100 بنسب متساوية.

اخلط الهلام المدمج مع الرابط المتقاطع سيلجارد 184 عند 0.36٪ من الحجم الكلي لإنتاج صلابة ركيزة تبلغ 13 كيلوباسال. لإنتاج ركيزة طرية بصلابة 0.3 كيلوباسال، تجاوز إضافة الرابط المتقاطع ثم اخلط المحلول ببطء لمدة 15 دقيقة. ضع خليط NuSil في غرفة إزالة الغازات وقم بإزالة الغازات لمدة 30 دقيقة.

الآن أزل جل PDMS بعناية من القالب المخصص وضعه على غطاء 40 ملم دون تمزيقه. بعد ذلك ضع جل PDMS في جهاز الترميز الدوراني. بيبت 100 ميكرولتر من خليط NuSil على المنطقة السالبة من هلام PDMS متساوي الخواص.

ثم قم بعمل ماصة بحجم 50 ميكرولتر من خليط NuSil على المنطقة السالبة من جل PDMS أحادي المحور. بعد ذلك الرمز على 7 G لمدة 50 ثانية. للوصول إلى سمك 100 ميكرومتر.

اترك الجل المطلي يستقر على سطح مستو في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعتين. ضع الجل في الفرن وجفف الجل عند 60 درجة مئوية طوال الليل. الآن ازرع مجرى الهواء البشري، وخلايا العضلات الملساء في آبار زراعة الخلايا المرنة واحتضنها تحت ظروف قياسية.

بعد ذلك، اخلط الخلايا بمحلول FLIPR Calcium Six للتصوير. لقياس قوة الجر، قم بتغطية ركائز جل NuSil من PDMS بطبقة من خرز الفلورسنت لتكون علامات ائتمانية. حضر محلول 0.025٪ من ميكرومتر واحد من كرات ميكروكسيلة معدلة كربوكسيلات أحمر بقطر ميكرومتر واحد في HBSS.

باستخدام خلط دوامة، قم بتدوير محلول الخرزة لمدة 10 ثوان. ثم تأخذ 880 ميكرولتر من محلول الخرزة إلى الهلام متساوي الخواص. أضف 420 ميكرولتر من محلول الخرزة إلى الجل المحوري الأحادي.

بعد حضن الجل في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة، أزل محلول الخرزة بعناية للحفاظ على توزيع الخرز. ثم استخدم مسحة قطن أو مناديل مختبر لمسح أي محلول متبق من سطح الجل بلطف برفق. بعد ذلك، استخدم مجهر مقلوب مزود بكاميرا ومحرك ضوئي وهدف جاف بحجم 10 أضعاف.

اضبط الإثارة إلى 475 × 40 نانومتر والانبعاث إلى 555 × 50 نانومتر. الحصول على صور 16 بت بمعدل إطارات 2 هرتز أثناء تجارب التمدد. الآن ضع الجل متساوي الخواص على الناقلة ثم صور الخرزات الفلورية باستخدام مجهر مقلوب مزود بهدف جاف بحجم 10 أضعاف التقط الصور في حالة ما قبل التمدد.

التقط الصور باستمرار طوال بروتوكول التمدد في مركز الركيزة. أعد تركيز المجهر في وضعية التمدد إذا لزم الأمر قبل التقاط الصور. تحليل الصور باستخدام كود MATLAB مخصص يعتمد على مجهر قوة الجر في فورير لحساب متجهات الإزاحة وحقول الانفعال المستوية المقابلة.

تمثيل البيانات كمتوسط التجارب النهائية. تطبيق إزاحة 240 ميكرومتر تسبب في تحرك خرز الفلورسنت شعاعيا نحو الخارج من المركز. كشف مجهر قوة الجر عن حقل إزاحة متساوي الخواص مع متجهات تشع من المركز وتزداد في القطر مع المسافة.

حقل الإزاحة متساوي الخواص يولد حقل إجهاد مستوي متجانس. زيادة الإزاحة إلى 1000 ميكرومتر أدت إلى زيادة متجهات الإزاحة مع الحفاظ على الاتجاه الشعاعي. زاد المجال المقابل للإجهاد عند 1000 ميكرومتر في القدر مع بقائه متماثلا شعاعيا.

في الجل الأحادي المحاور الذي يخضع لإزاحة 250 ميكرومتر، كانت متجهات الإزاحة مصطفة بشكل رئيسي على محور واحد، بما يتوافق مع الإجهاد المحوري الأحادي. كانت موجات الإجهاد تعكس بشكل وثيق إزاحات المحرك المبرمجة وظلت متزامنة عبر ثلاث دورات متكررة. ظلت قيم الإجهاد عند أقصى إزاحة ثابتة عبر ثلاث عينات مستقلة.

عند تطبيق إزاحة عابرة تصل إلى 5,555 ميكرومتر، أنتجت سلالات تتراوح بين أكثر من 0.1٪ إلى 12٪، أما الإجهاد العابر 0.5٪ فزاد في الكالسيوم داخل الخلية، ويظهر ذلك كزيادة في شدة الفلورة بعد التمدد. باستخدام نقالة التيار الخاصة بنا، يمكن للباحثين إجراء تصوير الكالسيوم للخلايا الحية، ومجهر قوة الجذب، وقياس الاستجابات الميكانيكية الخلوية للتمدد المتساوي أو أحادي المحور. خطوة حاسمة هي التأكد من أن الجل يتصلب على سطح مستو، حيث أن السمك غير المتساو قد يغير تركيز الركيزة ويقلل من وضوح البصر أثناء التصوير الحي.

يمكن للدراسات المستقبلية دراسة إعادة توجيه الهيكل الخلوي الناتج عن التمدد، وحالات الإجهاد المرضي المتعلقة بالربو أو إصابات الرئة، وعبر أنواع خلايا متنوعة.