التعديل المعتمد على الليغاند الكولينية لاقتران الفسفرة التأكسدية في خلايا الورم العصبي BE(2)-C المنفذة للأديجيتونين

الهدف العام من هذه التجربة هو إثبات طريقة لتقييم الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في خلايا الورم الأرومي العصبي المزروعة السليمة باستخدام النفاذية الانتقائية وتركيبة مثبطات الركيزة. تقليديا، يتم تقييم التنفس الميتوكوندري باستخدام أجهزة مثل جهاز قياس الهواء عالي الدقة Oroboros O2K، وقطب الأكسجين من نوع كلارك، ومحلل Seahorse XF. الطرق التقليدية التي تعتمد على نسبة ميتوكوندرية معزولة أو غنية من الأنسجة أو الخلايا غالبا ما تضر ببنية الميتوكوندريا.

على سبيل المثال، تكشف صورة المجهر الإلكتروني الناقل هذه للميتوكوندريا المعزولة من قشرة الفئران عن تباين واضح في السلامة الهيكلية اعتمادا على ما إذا كانت الميتوكوندريا مغلفة داخل الأطراف ما قبل المشبكية أم لا. الميتوكوندريا التي تبقى مغلفة داخل الأطراف قبل المشبكية تبدو سليمة هيكليا، كما هو موضح من الأسهم السماوية في هذه الصورة. على النقيض من ذلك، غالبا ما تظهر الميتوكوندريا غير المغلفة أو التي تفتقر إلى البنية الغشائية المحيطة مشوهة، كما تمثلها الأسهم الصفراء.

يستخدم محلل Seahorse Flex عادة لدراسة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا في كل من الخلايا المزروعة والميتوكوندريا المعزولة. في التحليل الخلوي المزروع، يتم الحفاظ على البنية الخلوية وشبكات الإشارة. ومع ذلك، فإن غشاء البلازما في الخلايا السليمة غير منفذ للعديد من ركائز دورة الأحماض الثلاثية الكربوكسيليك.

هذا يحد من نطاق التحليل الأيضي مقارنة بالميتوكوندريا المعزولة، التي تفتقر إلى حاجز غشاء بلازما، لكنها غالبا ما تظهر الآثار البنيوية. لذا، كلا النظامين لهما حدود جوهرية. تستغل التقنية المعروضة هنا حقيقة أن غشاء البلازما غني بالكوليسترول، بينما يحتوي الغشاء الميتوكوندري على كمية قليلة جدا.

باستخدام منظف مرتبط بالكوليسترول مثل ديجيتونين، يمكننا اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي مع إبقاء الغشاء الميتوكوندري سليما. تسمح هذه الطريقة بدخول الركائز والمثبطات الميتوكوندرية إلى داخل الخلية دون المساس بسلامة العضيات. وبالتالي، تمكن هذه التقنية من التحليل الوظيفي للميتوكوندريا في سياق الخلايا السليمة، مما يجمع بين ميزة بنية الخلية الكاملة وإمكانية الوصول إلى اختبارات الميتوكوندريا المعزولة.

ابدأ التجربة بطبق زراعة تحت التقاء لخلاياك. اغسل الخلايا بلطف باستخدام محلول فوسفات معقم أضف كمية مناسبة من محلول ترايتون لتغطية طبقة الخلية الأحادية بشكل متساو. بعد الحضانة، أزل الطبق ونقره أو هزه بلطف أفقيا للمساعدة في إزاحة الخلايا.

باستخدام ماصة ومتحكم بحجم خمسة مل، قم بعمل ماصة تعليق الخلية للأعلى والأسفل عدة مرات لتفكيك أي كتلة وتحقيق تعليق خلية واحدة. افحص تعليق الخلية تحت المجهر للتأكد من وجود تعليق خلية واحدة موحد. عد الخلايا باستخدام جهاز قياس الدم أو عداد الخلايا الآلي.

اضبط تركيز الخلية بحيث يحتوي 100 ميكرولتر من التعليق على حوالي 10,000 خلية. قم بسرع 100 ميكرولتر من تعليق الخلية بحذر في كل بئر من صفيحة اختبار Seahorse XF. اترك واحدة فارغة لتكون نقطة تحكم خلفية أثناء الفحص.

حضن الصفيحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة ساعتين إلى ثلاث ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق بقاع البئر. بمجرد تثبيت الخلايا، أضف بلطف 300 ميكرولتر من وسط التحليل إلى كل بئر. أعد الصفيحة إلى الحاضنة واحتضن الغرفة طوال الليل للسماح للخلايا بالاستقرار والنمو.

تأكد من أن الخلايا تشكل طبقة أحادية موحدة عبر قاع كل بئر. تجنب الازدحام. يجب أن تكون الخلايا متقاطعة، ولكن ليست متقاطعة بشكل مفرط، لضمان أداء التحليل الأمثل.

في الليلة التي تسبق التجربة، قم بترطيب خرطوشة مستشعر XFp 24 بإضافة مل واحد من مخزن المعايرة لكل بئر. بدلا من ذلك، يمكنك استخدام محلول ملحي من الفوسفات، درجة الحموضة 7.4. اترك الخرطوشة في درجة حرارة الغرفة طوال الليل على السرير.

لا يتطلب الأمر الحضانة في حاضنة غير COT عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لأن الخرطوشة ستتوازن مع درجة حرارة الغرفة أثناء عملية التحميل. اتصل بجميع المحاليل المجمدة ومخزن الفحص الدقيق للدبقية مرتين في درجة حرارة الغرفة. افحص الرقم الهيدروجيني، يجب أن يكون 7.4.

قم بالتعديل إذا لزم الأمر. جهز جميع الركيزة ومحاليل الحقن وتحقق من درجة الحموضة مرة أخرى. احتفظ بجميع المحاليل على الثلاجة حتى الاستخدام.

حضر أنابيب الطعام الموسومة ب A وB وC وD لحل منافذ حقن الخرطوشة بأجهزة الاستشعار. من الأفضل صنع محاليل تحتوي على مثبطات أو ركائز خاصة لكل منفذ. باستخدام ماصة متعددة القنوات، قم بتحميل 50 ميكرولتر من كل محلول حقن في المنافذ المعنية، من A إلى D، بحذر.

شغل المحلل الحيوي Seahorse قبل ساعة إلى ساعتين من التجربة للسماح للحاضنة الداخلية بالاستقرار عند 37 درجة مئوية. ضع علامة على كل جيد، وقم بتجميع حسب تصميم التجربة الخاص بك، وإرشادات Wave Desktop 2.6. برمج المحلل الحيوي للمزيج المناسب والوزن ودورة القياس.

راجع الجدول 8 للمرجعية. من المهم تعطيل خيار التوازن في بداية دورة القياس. إبقاؤه سيطيل مدة التجربة بشكل غير ضروري وقد يستنزف الركائز.

تشغيل الجهاز سيقوم أولا بمعايرة خرطوشة المستشعر، ويستغرق ذلك حوالي 15 دقيقة. ابدأ بتحضير لوحة الخلية مباشرة بعد وضع خرطوشة المستشعر في وضع المعايرة. استنشق المخزن بحذر دون إزعاج الخلايا عند حوالي 700 ميكرولتر من محلول التحليل الميتوكوندري 1x لكل بئر مع الخلايا الملتصقة، واترك الصفيحة تستقر دقيقة واحدة لتستقر.

استنشق الحاجز من كل بئر بعناية دون إزعاج الخلايا الملتصقة. كرر خطوة الغسالة ثلاث مرات لضمان اكتمال الوسط. بالتوازي، أضف 50 ميكرولتر من مخزن التحليل الميتوكوندري إلى بئر خلفية بدون خلايا.

استخدم الغضروف الهلالي كمرجع بصري لثبات الحجم. استنشق المخزن بحذر من الآبار التي تحتوي على الخلايا، مع ترك حوالي 50 ميكرولتر للحفاظ على ترطيب الخلية. حضن الصفيحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية، إما في حمام مائي، مع إبقائها فوق سطح الماء أو في حاضنة غير فولاذية مع أي غلاف جوي مشبع لمنع التبخر.

قبل التحميل مباشرة في المحلل، أضف 450 ميكرولتر من مخزن الاختبار الميتوكوندري المسخن مسبقا والذي يحتوي على ركائز أو مثبطات أو أدوية حسب الحاجة إلى كل بئر، ليصل الحجم الكلي إلى 500 ميكرولتر. اللوحة الآن جاهزة لإجراء الاختبار باستخدام خرطوشة المستشعر المعايرة في محلل الأحياء Seahorse. أولا، نقوم بإجراء اختبار اقتران لفحص درجة الاقتران بين نظام نقل الإلكترونات والفسفرة التأكسدية.

يساعد اختبار الاقتران في التمييز بين وظيفة الميتوكوندريا والخلل. في هذا الرسم البياني لنظام نقل الإلكترونات الميتوكوندرية، نظهر مثبطات محددة مركبة واحدة وثلاثة وخمسة إلى جانب العقد الخاصة بالركائز المختلفة مثل البيروفات أو المالات والسوكسنات، التي تتبرع بالإلكترونات للنظام. هذا التصور مفيد لفهم كيفية عمل الاختبار ودور الركائز والمثبطات المختلفة.

نفحص أولا تركيزين مختلفين من الديجيتونين، خمسة ميكروموللار و10 ميكرومولار، لفعاليتهما في تسهيل نقل الإلكترونات عبر غشاء البلازما وتمكين اختبار الاقتران. في هذا الاختبار، تم تقييم مستوى الترابط التنفسي من خلال قياس معدل استهلاك الأكسجين بشكل متسلسل في وجود السوكسينات كركيزة، وروتينون كمثبط معقد واحد. ثم تم حقن ADP، أوليغومايسين، FCCP ومضاد الميسين A بشكل متتالي، وتم تسجيل قياسات OCR بعد كل حقنة.

تظهر اللوحة اليسرى مخططات خطية توضح توتر الأكسجين الحركي داخل الحجرة الدقيقة العابرة. عادة ما يجب أن تبقى هذه القيمة بين 100 و200 ملم زئبق لضمان الكشف ضمن النطاق الديناميكي للحساس. تم إنشاء هذه البيانات باستخدام وضع النقطة إلى النقطة في برنامج Agilent Wave، الذي يعرض الضبط الضوئي على الوضوح الضوئي كسلسلة من المعدلات عبر فترة القياس، مما يسمح بتصور التغيرات الديناميكية، لا سيما زيادة نقل السكسينات بمقدار 10 ميكرومولارات مقارنة بخمسة ميكرومولار، مما أدى إلى انخفاض توتر الأكسجين في الحجرة الدقيقة، وبالتالي زيادة امتصاص الأكسجين.

كشف رسم البيانات التي تم الحصول عليها من هذه التجارب أن التنفس القاعدي بوساطة المركبات من الثاني إلى الرابع كان أعلى بشكل ملحوظ عند 10 أرجل ميكرومولر مقارنة بخمسة ميكروموللار، مما يشير إلى نقل أكثر كفاءة عبر غشاء البلازما المنفذ عند التركيز الأعلى. استنادا إلى هذه الملاحظة، وبالنظر إلى أن 10 ديجيتونين ميكرومولر وفرت نفاذية مثالية، قمنا لاحقا بتقليل عدد الخلايا إلى 20,000 خلية لكل بئر لتقليل التنفس القاعدي. ضمن هذا التعديل بقاء أي تعزيز تنفسي ناتج عن الدواء أو الركيزة ضمن نطاق الكشف الديناميكي للنظام.

بمجرد تحسين تركيز الأديجتونين وعدد الخلايا، تم إجراء اختبار الاقتران التالي لتقييم تأثيرات المنشطات والمضادات على التنفس الميتوكوندري. أحد النتائج المهمة من هذه المجموعة من التجارب هو أنه في خلايا الديجيتونين غير المعالجة، انخفض التنفس القاعدي الذي تتوسط مركبات مدفوعة بالسوكسسينات من اثنين إلى أربعة بالإضافة إلى التنفس في الحالة 3 و3u بشكل ملحوظ. وهذا يشير إلى أن السوكسينات لم ينقل إلى داخل الخلية في ظروف غير منفاذة.

كشف رسم بيانات من عدة تجارب مستقلة أن المضاد المسكاريني الأتروبين قلل بشكل ملحوظ من التنفس القاعدي بوساطة مركبات من اثنين إلى أربعة في خلية الورم العصبي مقارنة بالمحفز المسكاريني الأستيل كولين الذي حافظ على مستوى تنفس مرتفع. علاوة على ذلك، كان التنفس في كل من الحالة 3 والحالة 3u أقل بشكل ملحوظ في الخلايا غير المنفاذة مقارنة بالخلايا المنفاذة، مما يؤكد فعالية الديجيتونين في اختراق غشاء البلازما بشكل انتقائي دون الإضرار بوظيفة الميتوكوندريا. يقوم اختبار تدفق الإلكترون بتقييم الانتقال التسلسلي للإلكترونات إلى سلسلة نقل الإلكترونات الميتوكوندرية، مما يساعد في تحديد آليات خلل أو تعديل الميتوكوندريا.

في المرحلة الأولى من الاختبار، عولجت الخلايا بالبيروفات، والمالات، وFCCP، مما أدى إلى مستوى عال من التنفس غير المترابط مدفوعا بمركبات من واحد إلى أربعة. أدى الإضافة اللاحقة للروتينون إلى تثبيط العقدة الأولى، مما قلل من التنفس القاعدي وعزل النشاط بين اثنين إلى أربعة مركبات. على الرغم من أننا لم نلاحظ فروقا ذات دلالة إحصائية بين الحالات المعالجة بالأدوية والضابطة، إلا أن ملاحظة مهمة كانت أن التنفس المدفوع بالسكسينات في حالة الحالة 3u كان أقل بشكل ملحوظ في الخلايا غير المنفذة، مما يشير إلى الدور الحاسم للديجيتونين الذي يمكن دخول السكسينات إلى الخلية.

باختصار، يقدم هذا البروتوكول طريقة موثوقة لدراسة الطاقة الحيوية للميتوكوندريا. يجمع بين الأهمية الفسيولوجية لبنية الخلية الكاملة ودقة اختبارات الميتوكوندريا المعزولة، مما يمكن من توصيل الركائز والمثبطات بشكل محكم مع الحفاظ على سلامة العضيات. من خلال تحسين تركيز الديجيتونين وكثافة الخلايا، يمكن للباحثين تحقيق قياسات دقيقة وقابلة للتكرار.

يعد هذا النهج القابل للتكيف مثاليا لاستكشاف التعديل الوظيفي الميتوكوندري بواسطة المستقبلات، ويوفر منصة قوية لأبحاث الأمراض واكتشاف الأدوية.