التشريح الدقيق بالليزر لنسيج كبد الفئران المثبت بالبارافورمالديهايد لتحليل الحمض النووي الريبي
April 17th, 2026
يصف هذا البروتوكول طريقة لعزل الحمض النووي الريبي من المناطق النسيجية المحددة في نسيج كبد الفئران المدمج مع مركب القطع المثالي المثبت بدرجة حرارة القطع المثلى باستخدام التشريح الدقيق بالليزر، مما يتيح تحليل التعبير الجيني المستهدف في المراحل اللاحقة.
تركز أبحاثنا بشكل رئيسي على الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بخلايا الكبد في سياق أمراض الكبد المزمنة. يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا في شرائح نسيج الكبد واستخراج الحمض النووي الريبي. على عكس بروتوكول FFPE، أو بروتوكول البارافورمالديهيد الثابت أو بروتوكول الأشعة المقطعية، يحفظ ويكرر، مما يتيح مناقشة دقيقة دقيقة وعينات عالية الجودة لتحليل OMI لاحقا.
لبدء تعريض غشاء القلم للضوء فوق البنفسجي لمدة أربع دقائق وثلاثين. غطي شرائح الشرائح ب 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر من بولي إل ليسين ودعها تجف في الهواء. أغلق حواف كل شريحة بوسط تثبيت محايد.
باستخدام عامل إزالة التلوث من RNase، امسح جميع الأسطح المتاحة من الكريوستات وجميع الأدوات. أستخدم 75٪ إيثانول. نظف الفرشاة والأدوات جيدا.
الآن، اضبط درجة حرارة الكريوستات على ناقص 20 درجة مئوية ودعها تستقر. استرجاع عينات الكبد من تخزين بدرجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. ضع العينات في غرفة التجميد لمدة لا تقل عن 15 دقيقة للتوازن.
ضع طبقة سمكية من مركب OCT بسماكة اثنين إلى ثلاثة مليمترات على مرحلة العينة. ثم ضع مرحلة العينة على رف سريع أو داخل غرفة التجميد لتصلب طبقة المركب مسبقا. بعد تطبيق كمية صغيرة من مركب OCT على الطبقة المتصلبة مسبقا، ضع كتلة الأنسجة المتساوية أفقيا على المركب وثبتها في مكانها لمدة 10 إلى 15 ثانية.
ثم قم بتركيب مرحلة العينة مع كتلة الأنسجة المرفقة على رأس عينة الكريوستات. الآن أدخل الشفرة بعناية بين ألواح التثبيت والألواح الخلفية من جانب واحد من جهاز التبريد. ثبت ذراع التثبيت لتثبيت النصل.
اضبط ضبط سمك الكريوستات إلى 10 ميكرومتر. اقطع الأنسجة إلى أقسام وركبها مباشرة على شرائح غشاء القلم المعالجة مسبقا داخل غرفة التجميد الدقيقة، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية ناقص 20 درجة مئوية. قم بإذابة الزلاجات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
اغسل السلايدات ثلاث مرات باستخدام RN ACE PBS Free أربع وعشر ثوان لكل غسلة. أضف محلول الهيماتوكسيلين المصفاة من ماير إلى أقسام الأنسجة لمدة خمس إلى عشر ثوان. ثم اغسل السلايدات ثلاث مرات بماء خال من الريبونوكليز لمدة 10 ثوان في كل غسلة لإزالة بقايا الهيماتوكسيلين.
قيم جودة التلوين تحت المجهر. باستخدام ورق ماص، جفف الشرائح واتركها تجف تماما في الهواء. امسح سطح طاولة المختبر بمادة إزالة التلوث RNase.
شغل جهاز التحكم ودع المجهر يكتمل التهيئة. قم بتدوير المفتاح باتجاه عقارب الساعة من وضع الإيقاف إلى وضع التشغيل لبدء نظام الليزر. شغل الكمبيوتر وشغل برنامج التشريح الدقيق لالتقاط الليزر.
ثم انتظر حتى يكتمل التهيئة. الآن أدخل أنبوب PCR معقم بسعة 0.2 ملليلتر في جهاز الجمع. باستخدام ماصة، أضف 10 ميكرولتر من محلول الهضم بروتيازي K إلى غطاء أنبوب PCR.
حمل جهاز الجمع في حامل عينة المجهر. في نافذة جهاز جامع التغييرات. اذهب لضبط نقطة المرجع، ثم ضبط تركيز الكاميرا لرؤية نقطة المرجع بوضوح، واستخدم أدوات التحكم بالسهام لمركزها إذا لزم الأمر.
حمل قسم من النسيج في حامل العينة بحيث يكون النسيج مواجها للأسفل ووضع الملصق إلى اليمين. اختر عدسة الهدف 10 x وحدد المناطق ذات الاهتمام ذات السمات المرضية المحددة. انتقل إلى قائمة الليزر.
انقر على معايرة، اختر نعم وأكمل المعايرة. في لوحة التحكم بالليزر، اضبط طاقة الليزر على 50، والفتحة على 5، والسرعة على تسعة. ثم استخدم شريط الأدوات الرسومي لرسم دائرة حول المنطقة المستهدفة.
اختر الشكل الواحد، ثم اضغط بداية القطع لإجراء التشريح الدقيق لالتقاط الليزر ووضع جهاز الجمع لجمع الأنسجة المفصولة. لالتقاط الوثائق والصور، اختر ملف واختر حفظ الصور لحفظ الصور قبل وبعد بالتنسيق المفضل. بعد جمع الخلايا المطلوبة، اضغط على التفريغ لإزالة المجمع من المرحلة.
تحقق من أن 10 ميكرولترات من محلول الهضم بروتياز K لا يزال موجودا في الغطاء وقم بتعويضه إذا لزم الأمر. أغلق الأنبوب وقم بإحكام عليه بإحكام. ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي.
خزن الأنبوب عند درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم استخراج RNA. تم رؤية قسم الكبد المصبوغ بالهيماتوكسيلين على شريحة القلم تحت المجهر قبل وبعد التشريح المجهري لالتقاط الليزر. تم جمع المناطق ذات الاهتمام التي تظهر تعبسا حويصليا دقيقا داخل غطاء أنبوب PCR.
الحفاظ على شكل الخلية سليما. إجمالي حمض الريبونوكلييك المستخرج من حوالي 1000 و2000 خلية من التشريح الدقيق المعزولة عند التقاط الليزر أنتج 110.7 نانوغرام و213.3 نانوجرام على التوالي. أظهرت جميع العينات نقاء عالي مع امتصاص بنسبة 260 × 280 نانومتر بين 1.9 و2.1.
كشف الرحلان الكهربائي الهلامي عن شرائط مميزة من حمض الريبو النووي الريبوزومي بطول 28 ثانية و18 ثانية. ملفات المحلل الحيوية لحمض الريبونوكلييك من 1000 خلية فقط. أعطى رقم سلامة حمض الريبونوكليك 6.7.
أظهر اختبار Q-R-T-P-C-R لجين التدبير المنزلي بيتا أكتين قيم عتبة دورة تتراوح بين 17 و19. أظهر تقييم المحلل الحيوي لمكتبات التسلسل المبنية من 50 نانوجرام من حمض الريبونوكلييك الكلي ذروة مميزة بين 300 و500 زوج قاعدة. أسفر تسلسل الحمض النووي الريبي لهذه المكتبات عن بيانات عالية الجودة مع درجات Q 20 وQ30، تجاوزت 90٪ ومعدل خطأ منخفض عبر النسخ المكررة.
اعتبار مهم هو منع مكافحة التحلل من خلال إيقاف التحكم، والتلوين السريع، والظروف المستقيمة خلال المعالجة. عند ترتيب هذا الإجراء، يمكن استخدامه لعملية PCR في الوقت الحقيقي وتسلسل باستخدام مفاتيح مكتبة محسنة للتجزئة. تم التأكد من ذلك في عينات الكبد.
يتيح هذا البروتوكول تحديد تصنيف مجموعات الكبد الفرعية ويدعم الأبحاث التي تركز على علم الأمراض.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article presents a detailed protocol for laser capture microdissection (LCM) and RNA extraction from paraformaldehyde (PFA)-fixed, OCT-embedded mouse liver sections. The method enables the isolation of specific histological regions for downstream transcriptomic analyses, ensuring high RNA purity and integrity suitable for sensitive applications such as qPCR and RNA sequencing.
Key Study Components
Area of Science
- Hepatology
- Molecular Biology
- Histology
Background
- Chronic liver diseases often require spatially resolved molecular analysis of hepatocyte subpopulations.
- Traditional FFPE methods can compromise RNA integrity, limiting downstream applications.
- LCM allows precise isolation of defined cell populations from complex tissues.
- PFA fixation and OCT embedding preserve tissue morphology and RNA quality for transcriptomic studies.
Purpose of Study
- To establish a robust protocol for isolating specific liver cell populations using LCM from PFA-fixed, OCT-embedded tissue.
- To extract high-quality RNA suitable for transcriptomic analysis from microscale samples.
- To validate the protocol's effectiveness for downstream applications such as qPCR and RNA sequencing.
Methods Used
- Preparation of pen membrane slides with UV exposure and poly-L-lysine coating.
- Cryosectioning of PFA-fixed, OCT-embedded mouse liver at -20°C.
- Hematoxylin staining and RNase-free handling throughout the workflow.
- Laser capture microdissection of histologically defined regions (approx. 1,000 cells).
- RNA extraction, quantification, and quality assessment (A260/A280 ratio, RIN, gel electrophoresis).
- Downstream validation by qPCR for β-actin and RNA sequencing with fragmentation-optimized library preparation.
Main Results
- RNA yields from 1,000–2,000 cells ranged from 110.7 to 213.3 ng.
- RNA purity was high (A260/A280: 1.9–2.1).
- RNA integrity number (RIN) averaged 6.7 ± 0.9, consistent with PFA fixation.
- qPCR for β-actin showed Ct values of 17–19, indicating good RNA quality.
- RNA-seq libraries showed characteristic peaks (300–500 bp) and >90% of bases at Q20/Q30 quality thresholds.
Conclusions
- This protocol enables precise, spatially resolved gene expression analysis in liver tissue.
- RNA extracted is of sufficient purity and integrity for sensitive downstream applications.
- The method supports hepatocyte subgroup profiling and pathology-focused hepatology research.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Laser capture microdissection (LCM) of paraformaldehyde-fixed, OCT-embedded mouse liver tissue enables spatially resolved transcriptomic profiling of defined cell populations, supporting mechanistic de-risking in early discovery. This approach provides high-purity RNA suitable for sensitive downstream analyses, facilitating confident target validation and disease-relevant pathway interrogation. The protocol addresses a critical inflection point for hepatology and pathology-focused R&D portfolios seeking robust, region-specific molecular insights.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables spatially precise interrogation of hepatocyte subgroups within complex liver tissue.
- Supports functional target validation by isolating histologically defined regions for RNA analysis.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking molecular signatures to specific pathological features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by providing high-quality, region-specific RNA data.
Screening & Assay Development
- Prepares validated biological samples for downstream qPCR and RNA sequencing workflows.
- Ensures assay reproducibility through standardized tissue processing and RNA quality metrics.
- Delivers quantitative outputs (e.g., Ct values, RNA integrity) for reliable compound evaluation.
- Enables platform reuse for multiple transcriptomic applications in liver disease models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns molecular profiling with disease-relevant histopathology for translational biomarker discovery.
- Maintains continuity from discovery through preclinical validation by supporting sensitive RNA-based analyses.
- Reduces biological risk in preclinical advancement decisions by ensuring sample integrity and data quality.
- Supports pathology-driven research in chronic liver disease models.
Pipeline & Workflow Integration
This LCM protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling targeted gene expression analysis from fixed tissue sections, bridging histological assessment and molecular readouts.
- Discovery Biology: Provides spatially resolved hypothesis testing and pathway clarification in liver tissue.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for assay development and validation.
- Analytics: Supplies high-purity RNA and robust quality metrics (A260/A280, RIN, Ct values) for comparative analyses.
- Translational Research: Connects histopathological features to transcriptomic profiles for biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable workflow for spatial transcriptomics in fixed tissue models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes sample preparation and RNA extraction for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient portfolio management.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of liver disease programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning, histological staining, and LCM instrumentation.
- Demands access to RNase-free facilities and analytical infrastructure for RNA quality assessment.
- Necessitates cross-team standardization of tissue processing and RNA extraction protocols.
- May require adaptation for other tissue types or disease models with validation.
- RNA integrity is inherently limited by PFA fixation but remains suitable for qPCR and RNA-seq.
