التشريح الدقيق بالليزر لنسيج كبد الفئران المثبت بالبارافورمالديهايد لتحليل الحمض النووي الريبي

تركز أبحاثنا بشكل رئيسي على الفيزيولوجيا المرضية المرتبطة بخلايا الكبد في سياق أمراض الكبد المزمنة. يتيح هذا البروتوكول عزل الخلايا في شرائح نسيج الكبد واستخراج الحمض النووي الريبي. على عكس بروتوكول FFPE، أو بروتوكول البارافورمالديهيد الثابت أو بروتوكول الأشعة المقطعية، يحفظ ويكرر، مما يتيح مناقشة دقيقة دقيقة وعينات عالية الجودة لتحليل OMI لاحقا.

لبدء تعريض غشاء القلم للضوء فوق البنفسجي لمدة أربع دقائق وثلاثين. غطي شرائح الشرائح ب 0.1 ملليغرام لكل ملليلتر من بولي إل ليسين ودعها تجف في الهواء. أغلق حواف كل شريحة بوسط تثبيت محايد.

باستخدام عامل إزالة التلوث من RNase، امسح جميع الأسطح المتاحة من الكريوستات وجميع الأدوات. أستخدم 75٪ إيثانول. نظف الفرشاة والأدوات جيدا.

الآن، اضبط درجة حرارة الكريوستات على ناقص 20 درجة مئوية ودعها تستقر. استرجاع عينات الكبد من تخزين بدرجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية. ضع العينات في غرفة التجميد لمدة لا تقل عن 15 دقيقة للتوازن.

ضع طبقة سمكية من مركب OCT بسماكة اثنين إلى ثلاثة مليمترات على مرحلة العينة. ثم ضع مرحلة العينة على رف سريع أو داخل غرفة التجميد لتصلب طبقة المركب مسبقا. بعد تطبيق كمية صغيرة من مركب OCT على الطبقة المتصلبة مسبقا، ضع كتلة الأنسجة المتساوية أفقيا على المركب وثبتها في مكانها لمدة 10 إلى 15 ثانية.

ثم قم بتركيب مرحلة العينة مع كتلة الأنسجة المرفقة على رأس عينة الكريوستات. الآن أدخل الشفرة بعناية بين ألواح التثبيت والألواح الخلفية من جانب واحد من جهاز التبريد. ثبت ذراع التثبيت لتثبيت النصل.

اضبط ضبط سمك الكريوستات إلى 10 ميكرومتر. اقطع الأنسجة إلى أقسام وركبها مباشرة على شرائح غشاء القلم المعالجة مسبقا داخل غرفة التجميد الدقيقة، مع الحفاظ على درجة الحرارة عند 20 درجة مئوية ناقص 20 درجة مئوية. قم بإذابة الزلاجات في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

اغسل السلايدات ثلاث مرات باستخدام RN ACE PBS Free أربع وعشر ثوان لكل غسلة. أضف محلول الهيماتوكسيلين المصفاة من ماير إلى أقسام الأنسجة لمدة خمس إلى عشر ثوان. ثم اغسل السلايدات ثلاث مرات بماء خال من الريبونوكليز لمدة 10 ثوان في كل غسلة لإزالة بقايا الهيماتوكسيلين.

قيم جودة التلوين تحت المجهر. باستخدام ورق ماص، جفف الشرائح واتركها تجف تماما في الهواء. امسح سطح طاولة المختبر بمادة إزالة التلوث RNase.

شغل جهاز التحكم ودع المجهر يكتمل التهيئة. قم بتدوير المفتاح باتجاه عقارب الساعة من وضع الإيقاف إلى وضع التشغيل لبدء نظام الليزر. شغل الكمبيوتر وشغل برنامج التشريح الدقيق لالتقاط الليزر.

ثم انتظر حتى يكتمل التهيئة. الآن أدخل أنبوب PCR معقم بسعة 0.2 ملليلتر في جهاز الجمع. باستخدام ماصة، أضف 10 ميكرولتر من محلول الهضم بروتيازي K إلى غطاء أنبوب PCR.

حمل جهاز الجمع في حامل عينة المجهر. في نافذة جهاز جامع التغييرات. اذهب لضبط نقطة المرجع، ثم ضبط تركيز الكاميرا لرؤية نقطة المرجع بوضوح، واستخدم أدوات التحكم بالسهام لمركزها إذا لزم الأمر.

حمل قسم من النسيج في حامل العينة بحيث يكون النسيج مواجها للأسفل ووضع الملصق إلى اليمين. اختر عدسة الهدف 10 x وحدد المناطق ذات الاهتمام ذات السمات المرضية المحددة. انتقل إلى قائمة الليزر.

انقر على معايرة، اختر نعم وأكمل المعايرة. في لوحة التحكم بالليزر، اضبط طاقة الليزر على 50، والفتحة على 5، والسرعة على تسعة. ثم استخدم شريط الأدوات الرسومي لرسم دائرة حول المنطقة المستهدفة.

اختر الشكل الواحد، ثم اضغط بداية القطع لإجراء التشريح الدقيق لالتقاط الليزر ووضع جهاز الجمع لجمع الأنسجة المفصولة. لالتقاط الوثائق والصور، اختر ملف واختر حفظ الصور لحفظ الصور قبل وبعد بالتنسيق المفضل. بعد جمع الخلايا المطلوبة، اضغط على التفريغ لإزالة المجمع من المرحلة.

تحقق من أن 10 ميكرولترات من محلول الهضم بروتياز K لا يزال موجودا في الغطاء وقم بتعويضه إذا لزم الأمر. أغلق الأنبوب وقم بإحكام عليه بإحكام. ثم قم بتدوير الأنبوب لفترة وجيزة في جهاز طرد مركزي.

خزن الأنبوب عند درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية حتى يتم استخراج RNA. تم رؤية قسم الكبد المصبوغ بالهيماتوكسيلين على شريحة القلم تحت المجهر قبل وبعد التشريح المجهري لالتقاط الليزر. تم جمع المناطق ذات الاهتمام التي تظهر تعبسا حويصليا دقيقا داخل غطاء أنبوب PCR.

الحفاظ على شكل الخلية سليما. إجمالي حمض الريبونوكلييك المستخرج من حوالي 1000 و2000 خلية من التشريح الدقيق المعزولة عند التقاط الليزر أنتج 110.7 نانوغرام و213.3 نانوجرام على التوالي. أظهرت جميع العينات نقاء عالي مع امتصاص بنسبة 260 × 280 نانومتر بين 1.9 و2.1.

كشف الرحلان الكهربائي الهلامي عن شرائط مميزة من حمض الريبو النووي الريبوزومي بطول 28 ثانية و18 ثانية. ملفات المحلل الحيوية لحمض الريبونوكلييك من 1000 خلية فقط. أعطى رقم سلامة حمض الريبونوكليك 6.7.

أظهر اختبار Q-R-T-P-C-R لجين التدبير المنزلي بيتا أكتين قيم عتبة دورة تتراوح بين 17 و19. أظهر تقييم المحلل الحيوي لمكتبات التسلسل المبنية من 50 نانوجرام من حمض الريبونوكلييك الكلي ذروة مميزة بين 300 و500 زوج قاعدة. أسفر تسلسل الحمض النووي الريبي لهذه المكتبات عن بيانات عالية الجودة مع درجات Q 20 وQ30، تجاوزت 90٪ ومعدل خطأ منخفض عبر النسخ المكررة.

اعتبار مهم هو منع مكافحة التحلل من خلال إيقاف التحكم، والتلوين السريع، والظروف المستقيمة خلال المعالجة. عند ترتيب هذا الإجراء، يمكن استخدامه لعملية PCR في الوقت الحقيقي وتسلسل باستخدام مفاتيح مكتبة محسنة للتجزئة. تم التأكد من ذلك في عينات الكبد.

يتيح هذا البروتوكول تحديد تصنيف مجموعات الكبد الفرعية ويدعم الأبحاث التي تركز على علم الأمراض.