بروتوكول لجمع التعليق أحادي الخلية من قرنية الفئران
أبريل 3, 2026
هنا، نقدم بروتوكولا للحصول على تعليق خلية واحدة عالية الجودة من قرنيات الفأر الكاملة من خلال الهضم المتسلسل باستخدام الكولاجيناز A والتريبسين. تنتج هذه الطريقة خلايا مفردة قابلة للحياة ذات سلامة RNA عالية، مما يجعلها متوافقة مع التطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي أحادي الخلية وقياس خلية التدفقy.
يقدم هذا البروتوكول بشكل أساسي طريقة للحصول على خلايا منفردة عالية الجودة من قرنيات الفئران السليمة. طريقتنا هي خلايا منفردة قابلة للحياة ذات سلامة RNA عالية، مما يجعلها متوافقة مع التطبيقات اللاحقة مثل خلية واحدة على طبقة سميكة وقطر تدفق الجسم. للبدء، ضع فأرة أنثى C57BL6 عمرها بين ستة إلى ثمانية أسابيع تم إعدادها على طاولة تشريح معقمة.
بعد شطف الجفون المغلقة ب PBS، استخدم مقص العيون لعمل شق على القطب الخلفي لكرة العين، وضع العين المعزولة بعناية في طبق بتري يحتوي على وسط ظهاري هرموني بارد جدا. بعد شطف كرة العين ثلاث مرات باستخدام 1XPBS مع 5٪ من البنسلين ستربتوميسين، استخدم مقص العيون والملاقط لعمل شق من القطب الخلفي نحو الطول القرني. افصل القرنية بلطف عن الصلبة والملتحمة على طول الحافة الليمبلية، ثم استخدم زوجين من الملقط، قم بإزالة العدسة والقزحية بالكامل.
بعد غسل نسيج القرنية ثلاث مرات باستخدام PBS، انقل النسيج النظيف إلى أنبوب جديد. أضف ملليتر واحد من خمسة ملليغرام لكل محلول كولاجناز، وقم بتقطيع الأنسجة إلى قطع بحجم حوالي 0.5 × 0.5 مليمتر باستخدام مقص العيون. حضن الأنبوب الذي يحتوي على شظايا القرنية بمحلول الكولاجيناز A في حاضنة زراعة الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة ساعة.
افحص الأنسجة كل 10 دقائق أثناء الهضم. عندما لا تبقى شظايا كبيرة من الأنسجة، قم بعمل الطرد المركزي للعينة بحرارة 300 جرام لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم استنشق السوبرناتينت بعناية. بعد ذلك، أعد تعليق الحبيبة في محلول 200 ميكرولتر من محلول EDTA بنسبة 0.25٪ تريبسين.
ضع الأنبوب في حاضنة زراعة الخلايا مضبوطة على 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لهضم شظايا الأنسجة المتبقية. وأخيرا، استخدم ماصة P1000 مزودة برأس واسع لتسخين الخليط بلطف للحصول على تعليق خلية واحدة. قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية كما تم شرحه سابقا، وإعادة تعليق حبيبات الخلية في PBS التي تحتوي على 0.04٪ BSA.
عند عد خلايا القرنية المعزولة باستخدام جهاز قياس الدم الخلوي، وجد أن ما مجموعه 1.05 مضروبا في 10 إلى قوة خمس خلايا تم الحصول عليها من ثماني قرنيات بمتوسط بقاء خلوي بلغ 94.6٪ ونسبة خلية واحدة تجاوزت 96.3٪، مما يؤكد ملاءمة التعليق للتطبيقات اللاحقة. أظهر تحليل التألق المناعي أن تعليق الخلايا يتكون من 83.5٪ خلايا ظهارية إيجابية لبان-CK، و13.5٪ خلايا سترومال إيجابية للقرنية، وحوالي 3٪ خلايا سلبية لكلا العلامتين. أظهر الحمض النووي الريبي المستخرج من تعليق الخلية الواحدة رقم سلامة RNA مرتفع حوالي 8.8 ونسبة RNA ريبوسومية 28S × 18S تبلغ حوالي 2.15، مما يؤكد جودة RNA ممتازة.
بعد الحصول على خلايا مفردة، يمكننا توصيف وظيفة خلايا القرنية واستكشاف العلامات السطحية. هذا المنطق هو دراسة التفاعلات بين الخلية. التحدي في هذه الطريقة هو فصل القرنية عن الأنسجة الأخرى عمليا.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
تقدم هذه المقالة بروتوكولاً قوياً لعزل معلقات خلوية أحادية عالية الجودة من قرنيات الماوس الكاملة. تدمج هذه الطريقة بين التشريح الدقيق للأنسجة والهضم الإنزيمي المتسلسل، مما يسمح بتحضير خلايا مفردة حيوية مناسبة للتطبيقات اللاحقة مثل تسلسل الحمض النووي الريبي للخلية الواحدة (scRNA-seq) وقياس التدفق الخلوي. يوفر هذا البروتوكول أعداداً كبيرة من الخلايا، وحيوية ممتازة، ويحافظ على سلامة الـ RNA، مما يسهل التحليل التفصيلي للتغاير الخلوي في القرنية.
المكونات الرئيسية للدراسة
مجال العلم
- طب العيون
- بيولوجيا الخلية
- تحليل الخلية الواحدة
خلفية علمية
- تُعد القرنية الطبقة الخارجية للعين، وهي ضرورية للرؤية والحفاظ على التوازن الداخلي لسطح العين.
- يتطلب تسلسل الحمض النووي الريبوزي أحادي الخلية (scRNA-seq) معلقات خلوية أحادية الخلية عالية الجودة.
- تتميز أنسجة القرنية بأنها كثيفة ومعقدة، مما يجعل عملية تفكيك الخلايا تحديًا.
- غالبًا ما تؤدي البروتوكولات الحالية إلى انخفاض حيوية الخلايا أو رداءة جودة الـ RNA.
الغرض من الدراسة
- وضع بروتوكول موثوق لتوليد معلقات من الخلايا المفردة من قرنيات الماوس السليمة.
- ضمان الحيوية العالية للخلايا وسلامة الـ RNA للتطبيقات اللاحقة.
- تمكين التحديد والتقدير الكمي الدقيق لأنواع الخلايا الرئيسية في القرنية.
الطرق المستخدمة
- تشريح القرنيات من فئران C57BL6 التي تم إخضاعها للقتل الرحيم.
- الهضم الإنزيمي المتسلسل باستخدام collagenase A و trypsin-EDTA.
- الفرم الميكانيكي والترتيت اللطيف للحصول على معلق من الخلايا المفردة.
- تقييم حيوية الخلايا باستخدام صبغ trypan blue والعد بواسطة مقياس كرات الدم hemocytometer.
- التلوين المناعي الفلوري لـ Pancytokeratin (الخلايا الظهارية) و Keratocan (خلايا السدى).
- تحليل سلامة RNA باستخدام المحلل الحيوي bioanalyzer.
النتائج الرئيسية
- تم الحصول على ما يقرب من 1.05 × 105 خلية من ثماني قرنيات.
- حيوية خلوية عالية (94.6%) ونسبة خلايا مفردة (96.3%).
- تكوين الخلايا: 83.5% خلايا طلائية إيجابية لـ pan-CK، و13.5% خلايا سدوية إيجابية لـ keratocan، وحوالي 3% سلبية لكلا العلامتين.
- رقم سلامة الحمض النووي الريبي (RIN) حوالي 8.8 ونسبة 28S/18S rRNA حوالي 2.15، مما يشير إلى جودة ممتازة لـ RNA.
الاستنتاجات
- ينتج هذا البروتوكول بشكل موثوق معلقات خلوية مفردة عالية الجودة من قرنيات الفئران.
- تعتبر التحضيرات الخلوية مناسبة للتطبيقات اللاحقة الدقيقة، بما في ذلك scRNA-seq.
- تسهل هذه الطريقة إجراء دراسات تفصيلية حول وظائف الخلايا القرنية والتفاعلات بين الخلايا.
الأسئلة الشائعة
الأهمية الصناعية التنفيذية
تعد المعلقات الخلوية الأحادية عالية الجودة من قرنيات الفئران ضرورية لدفع عجلة الأبحاث العينية في مرحلة الاكتشاف وتمكين التوصيف الخلوي عالي الدقة. يتناول هذا البروتوكول عقبة حرجة في تحضير خلايا أحادية حية وسليمة الحمض النووي الريبوزي (RNA) من الأنسجة العينية الكثيفة، مما يؤثر بشكل مباشر على موثوقية تحليلات الخلايا الأحادية اللاحقة. ويعزز التحضير الخلوي القوي من الثقة التنبؤية في التحقق من الأهداف ويدعم الاستمرارية الانتقالية عبر مسارات الاكتشاف وما قبل السريرية.
التطبيقات الاستراتيجية في البحث والتطوير في مجال الأدوية البيولوجية
الاكتشاف المبكر والتحقق من الهدف
- يتيح استقصاء التباين الخلوي للقرنية بدقة الخلية الواحدة.
- يدعم التحقق الوظيفي من الأهداف من خلال الحفاظ على حيوية الخلايا وسلامة الـ RNA.
- يسهل الحد من المخاطر الميكانيكية من خلال التحديد الدقيق لنوع الخلية.
- يعزز الثقة التنبؤية لاختيار الأهداف في المراحل المبكرة من أبحاث طب العيون.
الفحص وتطوير المقايسة
- يوفر معلقات خلوية أحادية ذات حيوية عالية ومعيارية لتطوير المقاييس الحيوية.
- يضمن القابلية للتكرار والمخرجات الكمية لتسلسل الحمض النووي الريبوزي (RNA) أحادي الخلية في الخطوات اللاحقة.
- يجهز مواد بيولوجية تم التحقق من صحتها لسير عمليات الفرز القابلة للتوسع.
- يتيح تقييماً موثوقاً لتأثيرات المركبات على مجموعات متميزة من خلايا القرنية.
الأبحاث الترجمية والقبل سريرية
- يتوافق مع النماذج ذات الصلة بالأمراض من خلال الحفاظ على التنوع الطبيعي لخلايا القرنية.
- يحافظ على جودة RNA لاكتشاف المؤشرات الحيوية الترجمية والتحقق من صحتها.
- يدعم قرارات التقدم المعدلة وفقاً للمخاطر من خلال ضمان استمرارية البيانات من مراحل الاكتشاف إلى المراحل قبل السريرية.
- يقلل من الغموض البيولوجي في الدراسات العينية قبل السريرية.
تكامل خطوط المعالجة وسير العمل
يدمج هذا البروتوكول بين مرحلة الاكتشاف المبكر والأبحاث قبل السريرية، مما يتيح انتقالاً سلساً من تفكيك الأنسجة إلى تحليل الخلايا المفردة والدراسات الوظيفية اللاحقة.
- بيولوجيا الاكتشاف: يدعم اختبار الفرضيات وتوضيح المسارات من خلال تمكين التنميط عالي الدقة للخلية الواحدة.
- الفحص: يوفر معلقات خلايا فردية كمية وقابلة للتكرار لضمان جاهزية المقايسات وفحص المركبات.
- التحليلات: يوفر مقاييس قوية لحيوية الخلايا، وتقدير كمية أنواع الخلايا، وسلامة RNA لإجراء التحليلات المقارنة.
- الأبحاث الانتقالية: يحافظ على التنوع الخلوي وجودة RNA من أجل مواءمة المؤشرات الحيوية والتحقق قبل السريري.
- إعادة الاستخدام المؤسسي: يضع بروتوكولاً موحداً قابلاً للتكيف عبر برامج أبحاث طب العيون.
التأثير التشغيلي والمؤسسي
- القيمة العلمية: تزيد من الثقة التنبؤية وتحد من الغموض الميكانيكي في التحقق من الهدف.
- القيمة التشغيلية: توفر تحضيرات للخلايا المفردة تكون معيارية وقابلة للتكرار والتوسع.
- القيمة الاستراتيجية: تمكّن من اتخاذ قرارات مدروسة بالاستمرار أو التوقف، وتعزز كفاءة رأس المال في مجال البحث والتطوير في طب العيون.
- التأثير على المحفظة: تدعم تحديد الأولويات المعدلة حسب المخاطر والنهوض بالأصول في مرحلة الاكتشاف.
اعتبارات التنفيذ
- يتطلب خبرة في تقنيات تشريح الأنسجة العينية والهضم الإنزيمي.
- يتطلب إمكانية الوصول إلى أجهزة مقايسات حيوية الخلايا، والفلورة المناعية، وتحليل سلامة RNA.
- يستلزم توحيد المعايير بين الفرق لضمان إمكانية التكرار ومقارنة البيانات.
- قابل للتكيف مع أنواع أخرى من الأنسجة الكثيفة من خلال تحسين البروتوكول.
- تعد الدقة في فصل الأنسجة أمراً بالغ الأهمية لتجنب التلوث وضمان نقاء العينة.
