اختبار تعادلية تقليل التألق لفيروس التهاب الكبد E لقياس عيارات الأجسام المضادة المعادلة
May 22nd, 2026
لا يوجد اختبار قياسي لتحييد الفيروس لفيروس التهاب الكبد E (HEV)، وهو فيروس RNA إيجابي غير سيتوباثي. هنا، يوصف اختبار تعادلية تقليل التألق (FRNT) يعتمد على قياس كمية بروتين الكبسيد الفيروسي الموسوم بالفلورية لتقييم فعالية الأجسام المضادة المضادة لفيروس HEV.
الغرض الرئيسي من اختبار تحييد القائم على تقليل الفلورة هو قياس قدرة التعادلية لمرشح اللقاح والأجسام المضادة ضد HEVE. الطبيعة السيتوباتية المعروفة ل HEV تحد من اختبار PRND. يركز هذا البروتوكول على التدريب القائم على المناعة PRND بحيث لرؤية الخلايا المصابة ولاحقا لدي - للبدء، عد خلايا HuH-7 التي تم تقسيمها حديثا.
ثم ضع غطاء زجاجي بدرجة مجهر في صفيحة ب 12 بئر، وزرع 0.2 مليون خلية لكل بئر في مليليتر واحد DMEM كامل مع 10٪ FBS. حضن الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، أضف 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل تحتوي على 1.8 مضروبة 10 إلى قوة أربع نسخ جينومية من g1-HEV المنقاة إلى الخلايا المزروعة.
حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. استخدم 500 ميكرولتر DPBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. أضف ملليلتر من DMEM مع 2٪ FBS إلى الآبار.
حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر DPBS، مع حضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بين كل غسل. أضف 500 ميكرولتر 4٪ بارافورمالديهايد إلى الخلايا، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.
ثم اغسل الخلايا بمتلازمة DPBS كما هو موضح سابقا. بعد الغسل النهائي، حضنها في DPBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 250 ميكرولتر من محلول الانسداد الذي يحتوي على 5٪ سيروم ماعز عادي، 0.5٪ ألبومين مصل البقري، و0.3٪ ترايتون X100 في DPBS.
حضن في شاكر لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة. أزل محلول المانع، واغسله مرة واحدة ب 500 ميكرولتر DPBS. ثم أضف 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية بتخفيف من واحد إلى 500.
حضانة الخلايا طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، اغسل الخلايا بمتلازمة DPBS ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من واحد إلى 1,000، وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.
قم بدورة حضانة الغسيل كما هو موضح سابقا. أضف 10 ميكرولتر من مادة مضاد التصبغ باستخدام DAPI على شريحة زجاجية. قم بتركيب غطاء الغطاء بحيث تكون الخلايا تواجه الكواشف مع تجنب فقاعات الهواء.
أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر للحفاظ عليه من أجل التصوير بالمجهر الكونفوكلي. عد خلايا HuH-7 التي تم تقسيمها حديثا. ثم ضع غطاء زجاجي بدرجة مجهر في صفيحة بسعة 12 بئرا، وزرع 0.2 مليون خلية في ملليتر واحد DMEM كامل لكل بئر.
في اليوم التالي، جهز تخفيفا متسلسلا بمقدار عشرة أضعاف لأجسام مضادة مضادة ل-ORF2 وجلوبولين مناعي الأرنب G في وسط خال من المصل، مع تركيز ابتدائي للأجسام المضادة 25 ميكروغرام لكل ملليلتر، وحتى تخفيف نهائي يصل إلى 10 إلى قوة ناقص خمسة. يجب أن يكون الحجم النهائي للتخفيف 100 ميكرولتر. ثم، أضف 1.8 في 10 إلى قوة أربع نسخ جينومية من g1-HEV المنقى لكل تخفيف للأجسام المضادة.
حضن خليط الأجسام المضادة للفيروس عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من DPBS. أضف خليط الأجسام المضادة للفيروس إلى الخلايا.
حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. اغسل الخلايا باستخدام مخزن 500 ميكرولتر. بعد إضافة DMEM مع 2٪ FBS، قم بالحضانة لمدة 72 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.
عالج الخلايا للتلوين المناعي الفلوري كما تم شرحه سابقا. بعد الحصول على صور الفلورة، افتح برنامج ImageJ. اختر ملف، وافتح الصورة.
ثم اختر Image، Type، وانقر على 8-بت لتحويل صورة RGB إلى صيغة 8-بت. قم بضبط العتبة باختيار Image واختيار Adjust، ثم Threshold، مع ضبط المستوى السفلي على 40، والمستوى العلوي على 255. اختر تحليل، اختر تحليل الجسيمات، وفعل عرض النتائج، ومسح النتائج، تلخيص، استبعاد الحواف، والمناطق المركبة ذات الاهتمام.
ثم اضغط على موافق للحصول على عدد النقاط الفلورية. احسب نسبة التحييد وNT50 كمضاد للوغ10 NT50، باستخدام الصيغة المقدمة. رسم الرسم البياني الذي يوضح المتوسط والانحراف المعياري لجميع الحقول.
تم اكتشاف مستوى كبير من حمض الريبونوكليك g1-HEV في الخلايا المصابة مقارنة بالخلايا المصابة بالوهمية. أكد اختبار التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ORF2 تعبير ORF2 في خلايا HuH-7 المصابة. تم تقدير مقياس التعادلية بنسبة 50٪ للجسم المضاد المضاد ORF2 بمقدار 2.1 مضروبا في 10 أس قوة ثلاثة.
تظهر الصور التمثيلية ظهور خلايا HuH-7 المصابة بالعدوى الوهمية وG1-HEV المصابة في اختبار تعادلية تقليل الفلورة. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة إمكانية تحييد الأجسام المضادة لفيروس التموين العالي وقياس عيار تعادلها بنسبة 50٪. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي عزل فيروس التهاب الكبد E المعدي وتلوين الخلايا بشكل صحيح والتقاط صور عالية الدقة.
يمكن استخدام طرق بديلة مثل RT-qPCR وELISA لتحديد عيار التعادل، لكنها تعاني من بعض القيود.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Overview
This article describes a fluorescence reduction neutralization test (FRNT) designed to measure the neutralization potential of antibodies against Hepatitis E virus (HEV). The method provides a valuable alternative to plaque reduction neutralization tests (PRNT), which are not feasible for non-cytopathic viruses like HEV. The FRNT enables researchers to estimate the 50% neutralization titre (NT50) of anti-HEV antibodies, supporting vaccine and therapeutic antibody development.
Key Study Components
Area of Science
- Virology
- Immunology
- Vaccine development
Background
- Virus neutralization assays assess the efficacy of antibodies or vaccines against specific viruses.
- PRNT is commonly used but unsuitable for non-cytopathic viruses such as HEV.
- HEV is a major cause of acute viral hepatitis and lacks widespread vaccine or therapeutic antibody availability.
- Reliable neutralization assays are needed to evaluate HEV vaccine candidates and antibody responses.
Purpose of Study
- To develop and describe a fluorescence-based neutralization assay for HEV.
- To provide a method for estimating the NT50 of anti-HEV antibodies.
- To facilitate the evaluation of vaccine candidates and antibody efficacy against HEV.
Methods Used
- HEV was neutralized with anti-HEV ORF2 antibodies or rabbit IgG.
- Neutralized virus was used to infect Huh7 cells.
- Immunofluorescent staining targeted the viral ORF2 protein.
- Fluorescent positive cells were quantified using ImageJ software.
- NT50 values were calculated based on fluorescence reduction.
Main Results
- The FRNT successfully estimated the NT50 of anti-HEV antibodies.
- The NT50 was determined to be 2.1 x 103 for the tested antibodies.
- The method is applicable to sera from immunized mice, HEV-recovered individuals, and laboratory-produced antibodies.
Conclusions
- The FRNT provides a practical and effective assay for measuring HEV-neutralizing antibodies.
- This method supports the evaluation of vaccine candidates and antibody-based therapies for HEV.
- It addresses the limitations of PRNT for non-cytopathic viruses.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
Quantitative measurement of neutralizing antibody titers against Hepatitis E virus (HEV) is critical for vaccine candidate evaluation and therapeutic antibody development, especially given the lack of cytopathic effect in standard cell culture. The fluorescence reduction neutralization test (FRNT) enables robust assessment of antibody efficacy where traditional plaque assays are not feasible, directly impacting early discovery and translational research pipelines. This capability supports portfolio decisions by providing actionable data on immunogenicity and neutralization potential for HEV interventions.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct quantification of antibody-mediated HEV neutralization for target validation.
- Supports mechanistic de-risking by confirming functional antibody-virus interactions.
- Provides predictive confidence for advancing vaccine and antibody candidates.
Screening & Assay Development
- Delivers a standardized, reproducible assay for measuring neutralizing titers in non-cytopathic virus systems.
- Facilitates quantitative comparison of candidate antibodies and sera from immunized or recovered subjects.
- Prepares validated biological systems for downstream screening and optimization workflows.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neutralization data with translational biomarker strategies for HEV.
- Enables continuity from discovery-stage antibody screening to preclinical efficacy assessment.
- Supports risk-adjusted advancement of vaccine and therapeutic antibody programs.
Pipeline & Workflow Integration
The FRNT method integrates into the discovery-to-preclinical continuum by providing a quantitative, reproducible readout of antibody neutralization for HEV, bridging early candidate selection and translational validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and biological de-risking by quantifying neutralization capacity.
- Screening: Offers assay readiness and reproducibility for evaluating multiple antibody or serum samples.
- Analytics: Provides quantitative NT50 measurements to compare neutralizing potency across conditions.
- Translational Research: Links in vitro neutralization to preclinical biomarker strategies for HEV.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for neutralization testing in non-cytopathic virus research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in HEV antibody evaluation.
- Operational Value: Standardizes neutralization testing for non-cytopathic viruses, improving reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables informed go/no-go decisions and capital-efficient advancement of HEV vaccine and antibody assets.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of candidates based on quantitative neutralization data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and quantitative image analysis.
- Needs access to Huh7 cell culture, immunostaining reagents, and fluorescence microscopy.
- Demands cross-team standardization for assay setup and data interpretation.
- Adaptation to other non-cytopathic viruses may require protocol optimization.
- Dependent on availability of validated anti-HEV antibodies and reference sera.