اختبار تعادلية تقليل التألق لفيروس التهاب الكبد E لقياس عيارات الأجسام المضادة المعادلة

الغرض الرئيسي من اختبار تحييد القائم على تقليل الفلورة هو قياس قدرة التعادلية لمرشح اللقاح والأجسام المضادة ضد HEVE. الطبيعة السيتوباتية المعروفة ل HEV تحد من اختبار PRND. يركز هذا البروتوكول على التدريب القائم على المناعة PRND بحيث لرؤية الخلايا المصابة ولاحقا لدي - للبدء، عد خلايا HuH-7 التي تم تقسيمها حديثا.

ثم ضع غطاء زجاجي بدرجة مجهر في صفيحة ب 12 بئر، وزرع 0.2 مليون خلية لكل بئر في مليليتر واحد DMEM كامل مع 10٪ FBS. حضن الخلايا طوال الليل عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي، أضف 500 ميكرولتر من الوسائط الخالية من المصل تحتوي على 1.8 مضروبة 10 إلى قوة أربع نسخ جينومية من g1-HEV المنقاة إلى الخلايا المزروعة.

حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. استخدم 500 ميكرولتر DPBS لغسل الخلايا ثلاث مرات. أضف ملليلتر من DMEM مع 2٪ FBS إلى الآبار.

حضن الخلايا عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 72 ساعة. اغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر DPBS، مع حضانها لمدة خمس دقائق في درجة حرارة الغرفة بين كل غسل. أضف 500 ميكرولتر 4٪ بارافورمالديهايد إلى الخلايا، وحضنها في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة.

ثم اغسل الخلايا بمتلازمة DPBS كما هو موضح سابقا. بعد الغسل النهائي، حضنها في DPBS لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. أضف 250 ميكرولتر من محلول الانسداد الذي يحتوي على 5٪ سيروم ماعز عادي، 0.5٪ ألبومين مصل البقري، و0.3٪ ترايتون X100 في DPBS.

حضن في شاكر لمدة ساعة على درجة حرارة الغرفة. أزل محلول المانع، واغسله مرة واحدة ب 500 ميكرولتر DPBS. ثم أضف 250 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية بتخفيف من واحد إلى 500.

حضانة الخلايا طوال الليل عند أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، اغسل الخلايا بمتلازمة DPBS ثلاث مرات كما هو موضح سابقا. أضف 100 ميكرولتر من الجسم المضاد الثانوي عند تخفيف من واحد إلى 1,000، وحضن لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في غرفة مرطبة.

قم بدورة حضانة الغسيل كما هو موضح سابقا. أضف 10 ميكرولتر من مادة مضاد التصبغ باستخدام DAPI على شريحة زجاجية. قم بتركيب غطاء الغطاء بحيث تكون الخلايا تواجه الكواشف مع تجنب فقاعات الهواء.

أغلق غطاء الغطاء بطلاء الأظافر للحفاظ عليه من أجل التصوير بالمجهر الكونفوكلي. عد خلايا HuH-7 التي تم تقسيمها حديثا. ثم ضع غطاء زجاجي بدرجة مجهر في صفيحة بسعة 12 بئرا، وزرع 0.2 مليون خلية في ملليتر واحد DMEM كامل لكل بئر.

في اليوم التالي، جهز تخفيفا متسلسلا بمقدار عشرة أضعاف لأجسام مضادة مضادة ل-ORF2 وجلوبولين مناعي الأرنب G في وسط خال من المصل، مع تركيز ابتدائي للأجسام المضادة 25 ميكروغرام لكل ملليلتر، وحتى تخفيف نهائي يصل إلى 10 إلى قوة ناقص خمسة. يجب أن يكون الحجم النهائي للتخفيف 100 ميكرولتر. ثم، أضف 1.8 في 10 إلى قوة أربع نسخ جينومية من g1-HEV المنقى لكل تخفيف للأجسام المضادة.

حضن خليط الأجسام المضادة للفيروس عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة واحدة. اغسل الخلايا ب 500 ميكرولتر من DPBS. أضف خليط الأجسام المضادة للفيروس إلى الخلايا.

حضن عند حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة ساعة. اغسل الخلايا باستخدام مخزن 500 ميكرولتر. بعد إضافة DMEM مع 2٪ FBS، قم بالحضانة لمدة 72 ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

عالج الخلايا للتلوين المناعي الفلوري كما تم شرحه سابقا. بعد الحصول على صور الفلورة، افتح برنامج ImageJ. اختر ملف، وافتح الصورة.

ثم اختر Image، Type، وانقر على 8-بت لتحويل صورة RGB إلى صيغة 8-بت. قم بضبط العتبة باختيار Image واختيار Adjust، ثم Threshold، مع ضبط المستوى السفلي على 40، والمستوى العلوي على 255. اختر تحليل، اختر تحليل الجسيمات، وفعل عرض النتائج، ومسح النتائج، تلخيص، استبعاد الحواف، والمناطق المركبة ذات الاهتمام.

ثم اضغط على موافق للحصول على عدد النقاط الفلورية. احسب نسبة التحييد وNT50 كمضاد للوغ10 NT50، باستخدام الصيغة المقدمة. رسم الرسم البياني الذي يوضح المتوسط والانحراف المعياري لجميع الحقول.

تم اكتشاف مستوى كبير من حمض الريبونوكليك g1-HEV في الخلايا المصابة مقارنة بالخلايا المصابة بالوهمية. أكد اختبار التألق المناعي باستخدام الأجسام المضادة المضادة ORF2 تعبير ORF2 في خلايا HuH-7 المصابة. تم تقدير مقياس التعادلية بنسبة 50٪ للجسم المضاد المضاد ORF2 بمقدار 2.1 مضروبا في 10 أس قوة ثلاثة.

تظهر الصور التمثيلية ظهور خلايا HuH-7 المصابة بالعدوى الوهمية وG1-HEV المصابة في اختبار تعادلية تقليل الفلورة. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة إمكانية تحييد الأجسام المضادة لفيروس التموين العالي وقياس عيار تعادلها بنسبة 50٪. الخطوة الحاسمة في هذا البروتوكول هي عزل فيروس التهاب الكبد E المعدي وتلوين الخلايا بشكل صحيح والتقاط صور عالية الدقة.

يمكن استخدام طرق بديلة مثل RT-qPCR وELISA لتحديد عيار التعادل، لكنها تعاني من بعض القيود.