تجارب صبغ المناعة واختراق الصبغة لتعريف بروتينات الوصلة الحاجز ذات الطيات الأساسية في ظهارة جنين ذبابة الفاكهة

يبحث بحثنا في الوظائف التطورية غير المغلقة لبروتينات الوصلة الحصانية، مع التركيز على تحديد وتوصيف المكونات الجديدة المشاركة في البنية والأدوار البيولوجية. يهدف هذا البروتوكول إلى توصيف تنظيم ووظيفة الإغلاق لوصلات التوتر الصوفية المطوية في الظهارة الخارجية الجلدية لأجنة ذبابة الفاكهة. للبدء، قم بتهجين ذباب الذبابة وذبابة الذبابة السليمة من الأنماط الجينية المناسبة، ووضعها في أقفاص جمع الأجنة مع أطباق عصير تفاح طازجة مدهونة بمعجون الخميرة.

دع البالغين يبيضون البيض المخصب على أطباق عصير التفاح. أزل الطبق من قفص جمع البيض وقم بتعتيق الأجنة لمدة 13 إلى 16 ساعة بعد وضع البيض عند درجة حرارة 25 درجة مئوية للوصول إلى المرحلة 16. ثم تثبت الأجنة في المرحلة 16 في محلول مثبت مناسب وتقوم بتلطيخ المناعي بالأجسام المضادة المطلوبة.

للحصول على أفضل النتائج، صور الأجنة على مجهر كونفوكال مع هدف غمر زيت 40x. بعد التركيز على الجنين المطلوب، اضبط شدة الليزر والكسب لتحقيق إشارة فلورية قوية دون أن يتسبب في تشبع أي بكسل. تحديد الأجنة في المرحلة 16 التي لا تعبر عن بروتين فلوري أخضر مشفر بالمتوازن، باستخدام مورفولوجيا الأمعاء الوسطى.

ركز الفحص على الغدة اللعابية أو الأمعاء الخلفية، ووضع المسح Z ليشمل أكبر قطر ممكن للفتحة لرؤية الغشية الجانبية الكاملة للخلية الظهارية. حدد متوسط خط مناسب وصور نسيج مستقطب في 20 جنين ضابط و20 جنينا من المرحلة 16 الطفرة في كورا 4. سجل البيانات فقط من الأجنة التي يكون فيها علامة التصاق متمركزة بشكل محكم في المنطقة الجانبية الخلفية للغشاء.

في الأجنة البرية من المرحلة 16، تقييم إثراء بروتينات الوصلة الحصفية المطوية على طول المنطقة القمية من الغشية الجانبية بالقرب من وصلة التصاقات. سجل التوزيع المستمر لعلامة الوصلة الشقية المطوية على طول الغشاء الجانبي في الطفرة. اصنع محلول صبغة جديد عن طريق إذابة 10 كيلو دتلتون ديكستران الموسوم بالرودامين إلى 1 ملليغرام لكل ملليلتر في فوسفات الصوديوم 0.5 مولي عند درجة حموضة 7.5، مع كلوريد بوتاسيوم 5 ملليمولات.

باستخدام أداة سحب الإبر، اسحب أنبوب شعري داخلي بقطر 1 ملم وقطر داخلي 0.5 ملم مع ألياف إلى إبرة زجاجية. بعد ذلك، قم بتحميل الإبرة الزجاجية في حامل الإبرة على جهاز تحكم دقيق ورتب المعالج بجانب مجهر مقلوب. وجه الإبرة بالقرب من الانزلاق المجهر قدر الإمكان، وخفضها إلى نفس مستوى Z مع جانب الشريحة.

اكسر طرف الإبرة بضربها على جانب شريحة المجهر. ارفع الإبرة فوق مستوى الشريحة وأزلها للتحميل. بعد ذلك، املأ أنبوب الشعيرات الدموية بالصبغة باستخدام أصغر رأس ماصة متاح.

أعد تعبئة الإبرة المملوءة في حامل الإبرة. اختبر تدفق دكستران 10 كيلو دالتون عن طريق حقن كمية صغيرة منها في قطرة من زيت الهالوكربون على سطح شريحة المجهر. باستخدام غطاء سماكة 2 بحجم 22 × 22 ملم رقم 2، أنشئ خطا متبعدا على طبق عصير التفاح.

ضع حوالي 25 جنينا لكل من السيطرة وكورا 4 متحول في المرحلة 16 أو 17 على طبق عصير التفاح. تأكد من أن نهاياتهم الخلفية تصطف على طول الخط، وأن الأسطح البطنية تواجه الأعلى. ثم ضع قطعة من الشريط اللاصق مزدوج الجانب على غطاء رقم 2 بحجم 22 × 22 ملم.

المس الشريط على خط الجنين وفرك غطاء الغطاء برفق لنقل الأجنة من اللوحة إلى الشريط ذو الوجهين. بعد ذلك، أضف قطرة من زيت الهالوكربون إلى شريحة المجهر وثبت غطاء الشريحة عن طريق السماح للعمل الشعري بخلق رابطة. وجه غطاء الغطاء أقرب إلى جانب المنزلق مقابل أي جزء متجمد.

جفف الأجنة لمدة ثلاث إلى خمس دقائق في وعاء مجفف، وغط الأجنة بالكامل بزيت الهالوكربون. ثبت الشريحة مع الأجنة على المجهر المقلوب بحيث تكون الأجنة متجهة للأعلى وبعيدا عن الهدف. قم بمحاذاة جهاز التلاعب الدقيق بحيث تواجه الإبرة الطرف الخلفي للأجنة بزاوية أقرب ما تكون موازية للأجنة، واضبط محور Z للمتحكم الدقيق بحيث يتوافق طرف الإبرة مع منتصف الجنين على طول المحور الظهري-البطني.

بعد ذلك، يتم حقن الأجنة عن طريق تحريك المرحلة بسرعة إلى الإبرة بحيث يدخل طرف الإبرة إلى الهيموكويل. حقن حوالي 0.2 إلى 0.5 نانولتر من الصبغة باستخدام حقنة بحجم 10-25 أو 50 ملليتر. اسحب الإبرة بسرعة وانقل المرحلة إلى الجنين التالي لحقن الصبغة.

ثم أضف زيت هالوكربون إضافي فوق الأجنة. غط الأجنة بغطاء رقم 2 مقاس 22 × 22 ملم لإنشاء طبقة زيتية متساوية بين الغطاء ومنع السحق. إجراء تصوير على مجهر مركب فلوري أو مجهر كونفوكال بعد حقن صبغة ديكستران.

على المجهر الكونفوكلي، احصل على كتلة Z عبر حوالي ربع عمق الجنين على طول المحور الظهري-البطني لتقييم تجويف القصبة الهوائية. افحص تجويف القصبة الهوائية، وهي غدة لعابية، أو الأمعاء الخلفية بحثا عن تراكم الديكستران الموسوم. سجل النمط الجيني ومرحلة النمو لكل جنين وما إذا كان الديكستران الموسوم يتراكم في أي عضو أنبوبي.

لاحظ الأجنة التي يكون فيها الفضاء المحيطي مصبوغ بقوة بالصبغة، حيث قد تمثل هذه الحقن عن غير قصد في تلك المساحة. في الأجنة البرية، كان الماكغلوبولين المرتبط بالمكملة (Mcr) موضعا موحدا على طول الغشية الجانبية في المرحلة 13، وأصبح أغنى في المنطقة القمية للغشية الجانبية في المرحلة 14، وكان موضعه بقوة في المنطقة الجانبية العليا، التي كانت قاعدية فقط على تقاطع الالتصاقات بحلول المرحلة 16. صبغة الأجسام المضادة القشرية حددت وصلات الفتحات الناضجة المطوية في الأجنة البرية من المرحلة 16 بطريقة مشابهة ل Mcr.

في أجنة كورا 4 الطافرة، فشل Mcr في تحقيق تحديد موقع قوي في القمم بحلول المرحلة 16 وبقي موزعا على طول الغشاء الجانبي. كان تحديد موقع E-cadherin مشابها في الأجنة من النوع البري وCora 4 في المرحلة 16 الطفرة. في الأجنة البرية من المرحلة 17 التي تم حقنها بسمك 10 كيلودالتون ديكستران موسوم بالرودامين، كانت الصبغة تحيط بالقصبة الهوائية لكنها لم تخترق التلومين.

في الأجنة الطافرة في المرحلة 17 من كورا 4، تراكمت الصبغة في تجويف القصبة خلال 10 دقائق من الحقن. يتيح هذا البروتوكول للباحثين تحديد ما إذا كان الجين يشفر النواة أو المكون المساعد لوصلات الحصم المطوي في أنسجة ذبابة الفاكهة الجنينية بثقة. مرحلة الأجنة أمر بالغ الأهمية عند تنفيذ هذه التقنية، لأنها تتطلب أجنة المرحلة 16.

تنضج التقاطعات السبعية مع مرور الوقت حتى تستقر بالكامل في المرحلة 16. نعتقد أن هذا البروتوكول يمكن تطبيقه بفعالية في الفحص الجيني المفتوح باستخدام خطوط تداخل RNA لتحديد جينات الربط الجديدة ذات القطع الصوفية المطوية.