التنميط الظاهري للأنماط السلوكية الشبيهة بباركنسون الناتجة عن العلاج المبكر في يرقات سمك الزرد بناء على تجربة سلوكية

نقدم بروتوكول سلوك متعدد المعايير لتحليل الأنماط الظاهرية الحركية وغير الحركية في يرقات سمك الزرد بشكل شامل. ينطبق هذا البروتوكول على نمذجة مرض باركنسون، وفحص الأدوية، والسمية العصبية البيئية، والدراسات التي تستخدم يرقات الأسماك. للبدء، ارتد معدات الحماية الشخصية المناسبة، بما في ذلك القفازات، ومعطف المختبر، ونظارات واقية.

قم بتخفيف محلول E3 بنسبة 100x بنسبة 1 إلى 100 باستخدام ماء فائق النقي لتحضير وسط قوي واحد. الآن اختر ذكور وإناث سمك الزرد البالغين الناضجين جنسيا. باستخدام أحواض التربية المزودة بفواصل قابلة للإزالة، قم بإجراء تربية محكمة.

في الساعة 8:00 مساء، ضع ذكور وأنثى أسماك الزرد في أقسام منفصلة من أحواض التكاثر بنسبة ذكرين إلى ثلاث إناث باستخدام فواصل لإبقائهما منفصلين. في صباح اليوم التالي الساعة 8:00 صباحا، أزل الفواصل للسماح بالتزاوج. اجمع الأجنة بعد ساعة واغسلها ثلاث مرات بماء نظيف للنظام.

ضع الأجنة في أطباق بتري بحجم 100 ملم تحتوي على 20 ملليتر من متوسط E3 الطازج. ثم حضن الأجنة عند 28 درجة مئوية تحت دورة ضوء 14 ساعة و10 ساعات مظلمة. بعد يوم واحد من الإخصاب، قم بإزالة الأجنة غير المخصبة والمشوهة وغير الطبيعية بعناية باستخدام ماصحة مرعى.

استنشق الوسط ببطء من حافة طبق البتري وأضف وسط جنين E3 طازج على طول جدار طبق البتري لتقليل الإزعاج على الأجنة البرية. بالنسبة للمجموعة المعالجة من MPTP، استخدم محلول MPTP بقطر 50 ميكرومول. بعد أربعة أيام من التسميد، قم بتعديل ماصة المراعي بحجم ثلاثة ملليتر عن طريق قطع 10 مليمترات من الطرف لتكوين قطر عريض.

في الساعة 6:00 مساء، استخدم الماصة المعدلة لاختيار يرقات سمك الزرد من كل مجموعة ونقل يرقة واحدة لكل بئر إلى صفيحة تحتوي على 96 بئرا. راقب كل بئر تحت مجهر استيريو للتأكد من أن كل يرقة سمكة زرد تبدو بصحة جيدة. تحقق من أن الزعانف مفتوحة وتتأرجح بانتظام، وأن الجسم منتصب، وأن سلم السباحة منتفخ.

بعد ذلك، نظف أسفل اللوحة بعناية لمنع الأوساخ من التأثير على نتائج تتبع الفيديو. ثم انقل صفيحة ال 96 بئر في الوسط إلى أسفل غرفة صندوق الحمار الوحشي. اختر وضع التكميم في برنامج تتبع الفيديو.

لمراقبة تنظيم الاستيقاظ أثناء النوم، اضبط ضبط الإضاءة ليطفئ الضوء في الساعة 10:00 مساء وتشغيله في الساعة 8:00 صباحا. قم بضبط معايير البرنامج بحيث يتم ضبط عتبة الكشف إلى 40، والتفجير إلى 25، والتجميد إلى أربعة، وإجمالي وقت المراقبة إلى 52 ساعة، ثم الحجم إلى 60 ثانية. ابدأ إجراء الاستيقاظ أثناء النوم الساعة 8:00 PM.To مراقبة استجابات الحركة الضوئية، وضع يرقات بعد خمسة أيام من التخصيب في صفيحة تحتوي على 96 بئر مع يرقة واحدة لكل بئر. ثم اضبط برنامج انتقال الضوء على صفر إلى 60 ثانية من الظلام، يليه 60 إلى 120 ثانية من الضوء المستمر.

ابدأ البروتوكول واجمع معايير الحركة كل ست ثوان خلال الاختبار الذي يستغرق 120 ثانية. أوقف البروتوكول عند 120 ثانية وقم بتصدير ملف البيانات. ثم ضع اليرقات في ظلام تام لمدة خمس دقائق لتأهيلها لاختبار ضوء الوميض المظلم التالي.

اضبط برنامج انتقال الضوء ليوصل ضوء الستروب عند 10 هرتز لمدة 60 ثانية. لتقييم التيجموتاكسي، اختر لوحين بستة آبار. املأ كل بئر بأربعة ملليلتر من متوسط E3.

بعد خمسة أيام من التسميد، اجمع يرقات سمك الزرد من مجموعة النوع البري والمجموعة المعالجة ب MPTP ووضعها في ست صفائح آبار منفصلة. قبل تقييم التاكسي، ضع ألواح البئر في صندوق الحمار الوحشي لمدة 15 دقيقة للسماح بالتأقلم. ثم استخدم دالة مساحة السحب لرسم دائرتين متحدتين المركز في كل بئر نصف قطر الدائرة الداخلية يساوي نصف نصف قطر البئر، وابدأ التقييم.

لتقييم الحركة، انقل يرقات سمك الزرد العمري خمسة أيام من مجموعة النوع البري ومجموعة MPTP المعالجة إلى صفيحتين منفصلتين تتكون من 12 بئرا. بعد تأقلم لمدة 15 دقيقة، اختر وضع التحليل الإلكتروني للتتبع وسجل نشاط الحركة لمدة خمس دقائق باستخدام نظام تتبع الفيديو الآلي. لاختبار الاستجابة للذعر، انقل اليرقات التي تبلغ من العمر خمسة أيام بشكل فردي إلى لوحين بطول 12 بئرا مع يرقة واحدة لكل بئر وملليلتر من متوسط E3.

ضع الألواح في صندوق الحمار الوحشي لفترة تأقلم خفيف مدتها خمس دقائق. شغل برنامج ZebraLab وفعل وضع التحليل عبر الإنترنت للتتبع. افتح واجهة تشغيل الضوء، ثم اختر، استخدم إحدى طرق التحفيز الثلاث أدناه، وفعل المحفزات المحسنة.

ثم اضبط طريقة البداية لتكون عند بدء الجلسة. في جدول الانتقال، حدد إيقاع الفلاش المظلم. اضبط البرنامج ليعمل بعد 21 ثانية، ثم اضبط الانتقال من واحد إلى خمس مللي ثانية مع شدة ضوء 100٪.

انتقل من اثنين إلى 2، 890 مللي ثانية مع شدة ضوء 100٪. انتقل من ثلاث إلى خمس مللي ثانية مع 0٪ شدة ضوء، ثم انتقل من أربع إلى 100 مللي ثانية مع 0٪ شدة ضوء. ضع علامة على قائمة الانتقالات المتكررة لضمان التلاشي الدوري، ثم ابدأ البروتوكول.

لاختبار تحدي الظلام الفاتح، انقل يرقات سمك الزرد إلى لوحين بسعة 24 بئرا مع يرقة واحدة لكل بئر وملليلتر واحد من متوسط E3. بعد تأقلم لمدة خمس دقائق في صندوق الحمار الوحشي، قم بتشغيل وضع تحليل التتبع عبر الإنترنت. ثم قم بضبط برنامج الضوء لست دقائق من الضوء المستمر، تليها أربع دقائق من الظلام الدامس.

في الدقيقة العاشرة، أوقف التسجيل السلوكي واحفظ البيانات. أزل الطبق بعناية من صندوق الحمار الوحشي. بعد كل تجربة سلوكية، رش وامسح جميع الأسطح التي لامسها MPTP بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم الطازج.

اجمع النفايات السائلة والصلبة التي تحتوي على MPTP ووضع علامات واضحة عليها كنفايات عصبية سامة خطيرة. عالج جميع المواد الملوثة بمحلول هيبوكلوريت الصوديوم الطازج. أظهرت يرقات سمك الزرد المعالجة آثار اضطراب في نشاط النوم واليقظة مقارنة بمجموعة النوع البري.

كما زاد إجمالي وقت النوم بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة. انخفض عدد فترات النوم خارج المنزل بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة بينما زاد متوسط مدة النوم. تأثرت نشاط الاستيقاظ ومتوسط النشاط بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة.

تحت الضوء المستمر، زاد مؤشر تجمد المجموعة المعالجة بشكل كبير. كما ارتفع بشكل ملحوظ تحت تحفيز ضوء الستروب عند 10 هرتز. أظهرت منحنيات الاستجابة الحركية الضوئية انخفاضا في التفاعل في المجموعة المعالجة.

أظهرت نتائج التتبع انخفاضا في السلوك الحركي والاستكشاف في المجموعة المعالجة. كما انخفضت نسبة السباحة الكلية ومتوسط سرعة السباحة بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة. كانت نسبة زمن حركة التجمد أعلى بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة، لكن نسبة زمن الحركة السريعة كانت أقل بكثير.

أدت الانتقالات المتناوبة بين الضوء والظلام إلى ظهور ذروات سرعة واضحة في اليرقات البرية. انخفضت مسافة السباحة بعد التحفيز والسرعة القصوى بعد التحفيز بشكل ملحوظ في المجموعة المعالجة. كما تأخر الكمون في بداية الحركة في السرعة القصوى بشكل كبير في المجموعة المعالجة.

التحدي الرئيسي هو تقليل المحددات الداخلية مع مراعاة التباين الفردي لضمان تحليل سلوك دقيق وقابل للتكرار في مستوى سمك الزرد. يمكن تطبيق التجميع السلوكي والتحليل الظاهري لكشف التأثيرات العصبية السامة الدقيقة واكتساب رؤى مغناطيسية أعمق. يمكن للدراسات المستقبلية تطبيق هذه المنصة على فحص الأدوية المعتمد من المخاطر والتقييم الدوائي في نماذج مرض باركنسون لأسماك الزرد.