تسلسل السائل الدماغي الشوكي من الجيل التالي في التحول الجيني للكشف عن مسببات الأمراض في الجهاز العصبي المركزي

هذا بروتوكول بحثي لتسلسل عينات سائل الدماغ الشوكي من الجيل التالي من الميتاجينوميك للسماح بالكشف عن مسببات الأمراض المحتملة داخل العينة. لا تأخذ بروتوكولات MNGS الحالية في الاعتبار انخفاض العائد الريبي داخل السائل الشوكي الشوكي. يقوم هذا البروتوكول بتحسين عدة خطوات لأخذ الكتلة الحيوية المنخفضة داخل هذه العينات، في الاعتبار.

لبدء إذابة عينات السائل الشوكي على الجليد، انقل 100 ميكرولتر إلى ملليلتر واحد من كل عينة إلى أنبوب بسعة 1.5 ملليتر، وقم بالطرد المركزي عند 16,000 جرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية. ثم قم بإزالة الماصة بعناية من السوبرناتانت، تاركا الحبيبة و100 ميكرولتر من السوبرناتانت. أضف 100 ميكرولتر من درع DNA RNA إلى ال 100 ميكرولتر المتبقية من المادة الفائقة والحبيبة وامزج جيدا.

ثم أضف 600 ميكرولتر من مخزن تحليل الحمض النووي الريبي DNA وامزجه عن طريق التوصيل بالماصات حتى يصبح المحلول متجانسا. قم بإجراء بروتوكول استخراج الحمض النووي والحمض النووي الريبي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة مع التعديلات المهمة التالية. قم بجميع خطوات الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة، باستثناء الغسل النهائي للحمض النووي RNA، والذي يجب أن يطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق.

لإزالة العينة، أضف 22 ميكرولتر من الماء الخالي من النيوكلياز مباشرة إلى مصفوفة العمود. ثم حضن لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد إزالة الماصة الإلوسية، يعود التدفق إلى مصفوفة العمود، ثم يقوم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة قبل نقل العينة إلى أنبوب تخزين جديد بسعة 1.5 مليليتر.

تقطع المكونات اللازمة لتجزئة الحمض النووي الريبي وتحضيرها في أنبوب PCR. حضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على 105 درجات مئوية. تخلط بيبيت الحمض النووي الريبي المجزأ والممهد مع ثمانية ميكرولترات من الماء الخالي من النوكلياز واثنين ميكرولتر من خليط إنزيمات تخليق الخيط الأول.

حضن الأنبوب في جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على 105 درجات مئوية. ثم امزج الحمض النووي المصنح بالخيط الأول مع 48 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. ثمانية ميكرولترات من مخزن تفاعل تخليق السلسلة الثانية، وأربعة ميكرولترات من خليط إنزيم تخليق السلسلة الثانية.

ضع الأنبوب في جهاز التسخين الحراري وحضن الأنبوب لمدة ساعة على درجة حرارة 16 درجة مئوية مع إغلاق الغطاء الساخن. بعد ذلك، قم بتنقية الخرزات المغناطيسية باستخدام نسبة 1.8 مرة من خرزات الطور الصلب القابلة للعكس في التثبيت المغناطيسي. سكب العينة في 53 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

انقل 50 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية التي تحتوي على CDNA مزدوج السلسلة المنقاة إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز. في هذه المرحلة، يمكن تجميد العينات عند ناقص 20 درجة مئوية خلال الليل. إذا تم تخزين العينة عند ناقص 20 درجة مئوية طوال الليل، فإذابتها على الجليد قبل إعادة التشغيل.

خلط بيبيت 50 ميكرولتر من CDNA مزدوج السلسلة المنقى مع سبعة ميكرولترات من محلول تفاعل تحضير النهاية، وثلاثة ميكرولترات من خليط إنزيم تحضير النهاية. ضع العينات في جهاز تدوير حراري وحضن على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة و65 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة مع إغلاق الغطاء المسخن. بعد ذلك، قم بخطوة ربط المحول على الجليد عن طريق إنشاء تخفيف من 1 إلى 100 للمحول في مياه خالية من النوكليز.

يتم تحويل خليط تفاعل التحضير النهائي إلى أنبوب يحتوي على 30 ميكرولتر من خليط الربط الرئيسي، وميكرولتر واحد من معزز الربط، و2.5 ميكرولتر من المحول المخفف. ضع العينات في جهاز تدوير حراري وحضن العينات على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة مع إغلاق الغطاء المسخن. بعد ذلك، انتقل فورا إلى تنقية الخرزات المغناطيسية باستخدام نسبة 0.9 مرة من خرز مغناطيسي قابل للعكس في الطور الصلب.

ثم يصب في 17 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكليز. انقل 15 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز. الآن يقوم محول تنقية الماصة بربط CDNA في أنبوب يحتوي على ثلاثة ميكرولتر من إنزيم المستخدم، و25 ميكرولتر من خليط Q 5 الرئيسي، و10 ميكرولترات من البرايمرات الفريدة المشفرة شريطيا.

ضع الأنبوب في جهاز تدوير حراري مع ضبط الغطاء المسخن على 105 درجات مئوية وحضن الأنابيب في الظروف المتاحة. قم بتنقية خرزات مغناطيسية نهائية باستخدام نسبة 0.8 ضعف من الخرزات المغناطيسية. ثم يسحب العينة إلى 23 ميكرولتر من الماء الخالي من النوكلياز.

انقل 20 ميكرولتر من المادة الفائقة النهائية إلى أنبوب PCR نظيف خال من النوكلياز. قم بقياس تركيز مكتبات العينات باستخدام مجموعة قياس الحمض النووي والفلوريمتر المقابل. تحقق من أن تركيزات التحكم في المياه أقل بكثير أو غير قابلة للقياس مقارنة بالعينات الأخرى.

تقييم حجم مكتبات العينات عن طريق تشغيل العينات على جهاز الرحلان الكهربائي الشعري الآلي. استخدم منصة الويب مفتوحة المصدر، Chan Zuckerberg ID لإجراء تحليل الميتاجينومية للكشف عن مسببات الأمراض. سجل الدخول إلى معرف تشان زوكربيرغ واضغط على رفع.

اختر الميتاجينوميات كنوع تحليل واختر ملفات FASTQ المدخلة من عملية التسلسل. أدخل معلومات العينة المطلوبة بما في ذلك اسم العينة، ونوع العينة CSF، ونوع النيوكليوتيدات RNA أو DNA. بعد الانتهاء من المعالجة، انقر على مجلد المشروع الذي يحتوي على العينات وانتقل إلى لوحة التلخيص.

قم بالتمرير للأسفل لفحص عدد القراءة لكل عينة. راجع نسبة القراءات التي اجتازت ترشيح مراقبة الجودة، ونسبة الضغط المكررة لتقييم مدى تحيز PCR في التضخيم. لتحديد أي تلوث DNA أجنبي داخل مجلد المشروع، اختر كل عينة تحكم في المياه وانقر على نموذج الخلفية لإنشاء النموذج.

أثناء التحليل، طبق النموذج واستخدم مرشحات العتبة لتحديد درجة NTZ أكبر من واحدة لإزالة الملوثات المحتملة. ثم حلل البيانات باستخدام البرمجيات الإحصائية المناسبة. أظهرت بيانات الرحلان الكهربائي الشعري وتخطيط الكهروبية مكتبة عينات CDNA كانت مجزأة بشكل زائد وتحتوي على معضلات محول غير مخصصة للتسلسل.

كانت مكتبة CDNA التي لم تتعرض لتلوث كبير بدايمر المحول جاهزة للتجميع والتسلسل. التحول الجيني للسائل الشوكي الدماغي رصد تسلسل الجيل التالي مسببات أمراض متنوعة في المجموعة أ و ب مع ممرض واحد على الأقل في 73.5٪ من عينات المجموعة أ و51.2٪ من عينات المجموعة ب. التحدي الرئيسي هو التوصيل الدقيق بسبب الأحجام المنخفضة إلى جانب التجفيف الحساس للوقت باستخدام B حيث يمكن أن يؤثر التجفيف الناقص أو الزائد على النتائج.

بينما يركز هذا البروتوكول المحدد على جانب اكتشاف الممرضات، يمكن استخدام نسخ RNA المضيف التي يولدها هذا البروتوكول لتحليلات إضافية لاحقة. لذا من المهم للدراسات المستقبلية مقارنة أداء هذا البروتوكول الخاص بتحضير المكتبة والتسلسل مع الطرق الناشئة المصممة للعينات المتفرقة أيضا، لمعرفة كيف يتطابق، ليس فقط من حيث اكتشاف مسببات الأمراض، بل أيضا في التحليلات النصية.