استخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة من براز الفئران باستخدام طريقة الحمض-مذيب ثنائية الطور

يتيح هذا البروتوكول استخراج الأحماض الدهنية قصيرة السلسلة أو SCFAs من عينات براز فئران منخفضة الإدخال لإجراء تحليل روتيني قائم على كروماتوغرافيا الغاز. تنتج ميكروبيوتا الأمعاء من خلال تخمير الألياف الغذائية، مثل الأسيتات والبروبيونات والبيوتيرات الكيميائية الكيميائية (SCFAs) التي تشمل الأسيتات والبروبيونات والبيوتيرات. تدرس على نطاق واسع لأنها مرتبطة بالأنماط السلوكية والاستيضية والفسيولوجية.

ومع ذلك، لا يزال قياس SCFAs في عينات البراز تحديا. هذه المستقلبات متطايرة، وغالبا ما توجد عند مستويات منخفضة، وتقاس في مصفوفات بيولوجية معقدة. في دراسات الفئران، غالبا ما تكون كمية البراز التي يتم جمعها من كل حيوان محدودة.

قد تتطلب الطرق القياسية الاشتقاق، أو حجم عينات كبير نسبيا، أو معدات متخصصة. هنا، يتم تقديم سير عمل لاستخراج مذيب الحمض ثنائي الطورين باستخدام حمض الهيدروكلوريك المخفف وأسيتات الإيثيل لاستخلاص SCFAs من عينات براز فئران منخفضة الإدخال بصيغة متوافقة مع تحليل GC الروتيني. لذا نبدأ بتخطيطنا الصحيح لنكمل بقية بروتوكولنا.

بعد ذلك لدينا علبة عينات مع عينات البراز المجمدة المميزة بشكل صحيح. بعد ذلك، قمنا بضبط الماصة بسعة 1000 ميكرولتر على 255. الآن لدينا تخفيفات HCl المسماة ب "مخفف الهيدروكلوريد".

نواصل تخصيص HCl لكل عينة من عيناتنا. الآن، نضع الإيثانول في بئر التنظيف الخاص بنا للملاقط. الآن، نستخدم نفس الإيثانول لصنع حمامنا للمدقة.

الآن، نأخذ عينات البراز ونضعها في قوارير الطرد المركزي. الآن، نستخدم مدقاتنا النظيفة لطحن كل عينة براز داخل قوارير الطرد المركزي الخاصة بها. نأخذ عيناتنا ونضعها على الدوامة لمدة لا تقل عن 10 ثوان أو حتى تختلط تماما.

نأخذ العينات المختلطة إلى جهاز الطرد المركزي ونجهزها. تأكد من التوازن الصحيح للجهاز الطرد المركزي. اضبط جهاز الطرد المركزي على 16,000 مرة في الغرام لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية.

بعد انتهاء 10 دقائق، قم بإزالة العينات من جهاز الطرد المركزي. أعد تسمية قوارير الطرد المركزي الجديدة التي تتوافق مع عيناتك. اضبط الماصة بسعة 200 ميكرولتر على 120.

أزل السوبرناتانت بحذر، وتأكد من عدم لمس الحبيبة. انقل المادة الفائقة إلى القوارير الجديدة الخاصة بك. يمكنك التخلص من الحبيبة.

أضف نفس الكمية من أسيتات الإيثيل إلى قواريرك الجديدة. أعد هذه العينات إلى جهاز الطرد المركزي. اضبط جهاز الطرد المركزي على 2، 374 مرة في الغرام لمدة 20 دقيقة عند أربع درجات مئوية.

بعد انتهاء 20 دقيقة، أزل عيناتك. أعد تسمية قوارير الطرد المركزي الجديدة التي تتوافق مع عيناتك. أعد ضبط الماصة إلى 120 ميكرولتر.

احذر من لمس الطبقة السفلية، فقط إزالة الطبقة العلوية. انقل المادة الفائقة إلى قوارير جديدة معنونة بشكل صحيح. انقل هذه العينات إلى صندوق العينة الخاص بك لتخزينها حتى إجراء تحليلات إضافية.

وأخيرا، ضع علبة عينات في فريزر بدرجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية. تم تخزين أليكوت SCFA المستخرجة، كل منها 120 ميكرولتر، عند درجة حرارة سالبة 80 درجة مئوية قبل القياس باستخدام كروماتوغرافيا الغاز. حدد التحليل الكمي ثمانية مستقبات SCFA، بما في ذلك المستقلبات الرئيسية: حمض الخليك، حمض البروبيونيك، وحمض البيوتيريك كما هو موضح في الشكل.

للتحقق من عزل SCFA، تم تقييم بيانات الكروماتوغرافيا الغازية من خلال اختبارات الاسترداد والقابلية للتكرار. تم تقييم الاسترداد من خلال زيادة عينات التحكم ذات تركيزات معروفة من المعيار الداخلي، في حين تم التحقق من قابلية التكرار من خلال تحليلات متكررة خلال وخلال الأيام. باختصار، يوفر هذا البروتوكول سير عمل لاستخراج SCFA من عينات براز الفأر منخفضة المدخلات.

لا يتطلب الاشتقاق وهو متوافق مع التحليل الروتيني القائم على GC. يمكن لهذه الطريقة دعم قياس SCFA البرازي في نماذج فئران متنوعة.