التقييم الوظيفي لحاجز ظهارية لثوية الفأر باستخدام أجهزة تتبع فلورية

هذا بروتوكول موحد لتقييم كمي سلامة الحاجز الظهاري اللثوي. هذا البروتوكول مفيد لدراسة أمراض خلل الحواجز واختبار الأدوية الترميمية للحواجز في اللثة. للبدء، قسم الفئران البرية الذكور C57BL/6J إلى ثلاث مجموعات تتكون من مجموعة ضابطة غير معالجة، ومجموعة التهاب دواعم السن الناتج عن الربط، ومجموعة التهاب دواعم السن الناجم عن Porphyromonas gingivalis.

اختر متتبعات فلورية ذات أطياف غير متداخلة، مثل ديكستران الموسوم ب FITC والرودامين B المسمى ب ديكستران. لتخفيف التراسك، اخلط جراما واحدا لكل لتر من FD40 وRD70 في جل 2٪ من كربوكسي ميثيل سليلوز. خزن الخليط المعد على الثلج.

بعد التأكد من عمق التخدير عبر رد فعل قرص الأصابع، استخدم كمامة فم لإبقاء تجويف الفم للفأر المخدر مفتوحا. ضع 50 ميكرولتر من خليط التتبع المحضر موضعيا على سطح اللثة الشفية في المنطقة الضاربة. اترك الخليط في مكانه لمدة 30 دقيقة ثم أعد تطبيقه إذا ابتلع.

بعد 30 دقيقة من تطبيق جهاز التتبع، ثبت الفأر في وضعية الاستلقاء على الكرتون وثبت الأطراف بشريط لاصق لتثبيت الحيوان. بعد ذلك، افتح تجويف الفم للفأر الذي تم إعداده وعزل الفك العلوي. نظف الأنسجة المحيطة بلطف وشطف العينة جيدا باستخدام PBS.

ضع الفك العلوي المعزول على شريحة زجاجية. ثم ضع طين النمذجة على كلا الجانبين لتثبيت وتثبيت غطاء الغطاء فوق العينة. ضع الفك العلوي المقسوع بعناية على حامل العينة المصمم خصيصا لضمان استقرار التصوير في مكانه.

باستخدام مجهر فوتوني واحد قائم مزود بهدف غمر مائي بمقدار 25X. ركز على منطقة الدعم المثبتة أسفل الفك العلوي والتقط صورا. اختر المنطقة المهتمة على السطح الظدي للضرس الثاني داخل الفك العلوي وابدأ التصوير فورا.

احصل على صور Z-stack بحجم خطوة ميكرومتر واحد، بدءا من سطح اللثة إلى عمق من 100 إلى 200 ميكرومتر لإعادة البناء ثلاثي الأبعاد. في البرنامج، اضغط على ملف واختر المجلد الجديد لإنشاء مجلد جديد لمجموعة البيانات وتعيين اسم وصفي. في تبويب الاكتساب، اضبط تنسيق XY على 512 × 512 بدقة 0.99 ميكرومتر لكل بكسل.

ثم اضبط عامل التكبير على واحد. بعد ذلك، اضبط أطوال موجات الإثارة إلى 488 نانومتر و561 نانومتر. قم بتكوين نوافذ الانبعاث على 500 إلى 550 نانومتر و570 إلى 620 نانومتر على التوالي.

بالنسبة للتصوير من سلسلة Z والتصوير ثلاثي الأبعاد، اختر وضع اكتساب ND. اضبط خطوة Z على ميكرومتر واحد وقم بتعديلها إذا لزم الأمر. بعد تكوين المعلمات، اختر الوضع المباشر لعرض منطقة اللثة في قنوات فلورية فردية ومدمجة.

ثم اضغط على تشغيل الآن لبدء الحصول على الصور. لقياس النفاذية، افصل شدة الفلورة في FD40 وRD70 إلى قنوات مختلفة. دمج شرائح محور Z دون طرح الخلفية.

ثم استخدم برنامج ImageJ لقياس شدة التألق لتقييم نفاذية الحاجز الطلائي. انقر على الملف واختر الفتح لفتح صورة الفك العلوي في ImageJ. ثم اضغط على الصورة وغير نوع الصورة إلى صيغة 8-بت للتحليل.

انقر على تحليل، اختر مجموعة القياسات. ثم تحقق من المساحة، المتوسط، والكثافة المتكاملة، واضغط على موافق للتأكد. ثم اختر القناة المطلوبة وضبط العتبة بالنقر على الصورة، ثم اختيار التعديل، واختيار العتبة.

فعل خيار الخلفية الداكنة لأخذ الخلفيات السوداء في الاعتبار. انقر على تحليل واختر مقاييس المجموعة. ثم تحقق من القيمة الرمادية المتوسطة وحدها إلى العتبة، وتأكد بالنقر على موافق.

باستخدام أداة الاختيار الحر، يمكنك تتبع مخطط منطقة الإشارة الفلورية يدويا على جانب الأنسجة اللثية. انقر على تحليل واختر القياس للحصول على قيم شدة الفلورة حيث تمثل الكثافة المتكاملة شدة الفلورة. انسخ نتائج القياس في جدول بيانات للحسابات ورسم الرسوم البيانية.

احسب متوسط شدة الفلورة لمجموعة الضابطين في جدول البيانات. اقسم قيمة شدة الفلورة لكل مجموعة تجريبية على متوسط مجموعة التحكم للحصول على شدة الفلورة النسبية. في المجموعة الضابطة، كان كل من المتتبعين الفلوريين محصورين إلى حد كبير في سطح اللثة.

في كل من المجموعتين المعالجتين بالربط وPorphyromonas gingivalis، لوحظ توسع كبير لكل من FD40 وRD70 إلى ظهارة اللثة. أظهر التحليل شبه الكمي زيادة كبيرة في شدة التألق لكل من FD40 وRD70 في مجموعتي الربط وPorphyromonas gingivalis. كشف التصوير ثلاثي الأبعاد عن توزيع أوسع وانتشار لفلورة تتبع حول الأوعية الدموية اللثية في مجموعات الربط ومعالجة بورفيروموناس اللثة مقارنة بالمجموعات الضابطة.

يقوم هذا البروتوكول بقياس نفاذية وسلامة الحاجز اللاذوي اللاصحي للفأر. يمكن دمج هذا البروتوكول مع الميكرو-CT لتحليل الصور متعددة الوسائط. يمكن للمزيد من الدراسات استكشاف أدوية إصلاح الحواجز والآليات الجزيئية في أمراض الفم.