التصوير عالي الدقة والإدارة المشتركة: بروتوكول للمجهر الكونفوكلي مع اكتشاف التعدد

يركز بحثنا على تطوير طرق تصوير فائقة الدقة المتاحة لتصور البنى تحت الخلوية الديناميكية، متجاوزة حد الحيود في المجهر التقليدي. طريقة فائقة الدقة تواجه السمية الضوئية، والتشغيل المعقد، والتحضير المتخصص. يقلل هذا البروتوكول من هذه الحواجز من خلال الكشف المتعدد المعتمد على الكونفوكلس.

للبدء، شغل الوحدة الرئيسية للمجهر، وحدة إطلاق الليزر، مصدر ضوء LED، وكمبيوتر التحكم. شغل برنامج تشغيل المجهر. من الواجهة الرئيسية، اختر GFP، ثم اختر إيقاف الضوء المنعكس.

انتقل إلى لوحة الاستحواذ. من قائمة العدسة الموضوعية المنسدلة، اختر العدسة الموضوعية المناسبة. لتصوير الخلايا الحية، قبل 45 إلى 60 دقيقة من التصوير، قم بتفعيل غرفة البيئة ونظام تثبيت التركيز النشط.

بعد تثبيت النظام، تحقق من الاستقرار باستخدام حساسات الحجرة. ضع زيت الغمر على عدسة الهدف الأمامية دون إدخال فقاعات. ضع العينة المحضرة على مرحلة المجهر.

ارفعه بحذر حتى يلامس غطاء الغطاء زيت الغمر. بعد ذلك، افتح برنامج الاستحواذ. اذهب إلى تبويب الاستحواذ واختر إنشاء تجربة جديدة.

الآن، أضف مسارات تصوير للفلوروفورات المستخدمة. لكل مسار، اضبط قطر الثقب الكونفوكلي على وحدة هواء واحدة. لتحسين طاقة الليزر، اختر القناة الأولى وانتقل إلى وضع المسح الحي.

اضبط قدرة الليزر الأولية على قيمة منخفضة، ثم اضبط كسب الكاشف إلى مستوى متوسط ضمن نطاقه الخطي. بعد ذلك، زد قوة الليزر تدريجيا حتى تصبح الهياكل المستهدفة مرئية بوضوح فوق الخلفية في الصورة الحية. قم بضبط حجم البكسل باستخدام زر أخذ عينات Nyquist الخاص بالبرنامج لحسابه تلقائيا.

بعد ذلك، اضبط وقت البكسل. الآن، اختر وضع المسح التسلسلي بين المسارات لتقليل التحدث المتقاطع. انقر على سناب للحصول على صورة واحدة.

احفظ الصورة مع البيانات الوصفية ذات الصلة. للحصول على إعدادات متسقة عبر الأقسام البصرية، تأكد من أن جميع معلمات التصوير مهيأة على مستوى بؤري أمثل واحد قبل تعريف مكدس Z. افتح تبويب الاستحواذ واختر وضع Z-stack.

حدد حجم الاهتمام باستخدام مسح مباشر سريع للتركيز أولا على الهيكل السفلي للاهتمام، ثم اضغط على تعيين الأخير أو الأسفل. اضبط التركيز بعناية إلى أعلى هيكل محل اهتمام واضغط على تعيين أولا أو أعلى. بعد ذلك ستعرض البرمجيات العمق الكلي.

تم تعيين حجم المكدس Z ليفي بمعيار أخذ عينات نيكويست. استخدم زر الأمثل لحسابه تلقائيا. بعد تكوين معلمات التصوير لكل قناة، قم بزيادة قوة الليزر أو زيادة الزيادة قليلا للإشارات الضعيفة مقارنة بصورة ثنائية الأبعاد واحدة.

ابدأ عملية الشراء لجمع كامل مجموعة الصور. للتصور، استخدم وحدة المعالجة الأصلية في المجهر. توليد إسقاطات بأقصى شدة لعرض جميع الإشارات البؤرية في صورة ثنائية الأبعاد واحدة.

ثم تقوم بتنفيذ عرض الحجم باستخدام خوارزميات البرنامج المدمجة لتوليد تمثيل ثلاثي الأبعاد. قم بضبط السطوع والتعتيم والإضاءة حسب الحاجة. بعد ذلك، تولد مقاطع عرضية متعامدة من XZ و YZ لفحص الامتداد المحوري والتسجيل.

أظهر التصوير الفلوري متعدد الألوان لخلايا COS-7 الثابتة أن النوى والميتوكوندريا والأنابيب الدقيقة كانت معلمة بوضوح مع تداخل ضئيل، مما يؤكد فعالية المسح التسلسلي والكشف المحسن. يدمج الإسقاط الأقصى للشدة الإشارات عبر جميع الأقسام البصرية، مما يبرز التوزيع المكاني للهياكل الموسومة بالفلورية. يوفر إعادة البناء ثلاثي الأبعاد رؤية واعية للعمق للعمارة العينة.

يتم مقارنة التصوير الزمني لخلايا HeP 3B الحية مع الميتوكوندريا الموسومة ب EGFP عبر الأوضاع. تظهر الإطارات الكونفوكال عبر نقاط زمنية هياكل واضحة، لكن فقدان الإشارة تدريجيا. إطارات الدقة الفائقة القياسية أو SR تظهر دقة أعلى، لكنها تزداد في تبييض الصور مع مرور الوقت.

تحافظ الصور فائقة الدقة السريعة أو صور SR-4Y على استقرار الفلورة حتى في النقاط الزمنية اللاحقة. يوضح رسم بياني متوسط شدة الفلورة في EGFP على مدى 100 نقطة زمنية أن وضع SR-4Y حافظ على الإشارة الأكثر استقرارا. تمت مقارنة أداء التصوير في خلايا COS-7 الثابتة عبر الأوضاع، وقدمت أوضاع الدقة الفائقة تفاصيل هيكلية أوضح من الكونفوكال الورقية.

أظهر قياس دالة الانتشار النقطي باستخدام حبيبات فلورية بقطر 100 نانومتر أن SR أيريسكان مع فك الالتفاف الفواصل اللاحق حسن الدقة الجانبية والمحورية مقارنة ب Airyscan SR وحده. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة شكل العضويات، وديناميكيات الهيكل الخلوي، وتزايد الجزيئات في كل من الخلايا الثابتة والحية بدقة تقارب 120 نانومتر. أهم اعتبار لهذا البروتوكول هو تحضير العينات الدقيق باستخدام زجاج تغطية عالي الجودة وتلوين محسن لضمان سلامة الإشارة للمعالجة فائقة الدقة.

وبعد هذا الإجراء، يمكن للباحثين إجراء تحليل صور كمي، مثل قياس نسبة الإشارة إلى الضوضاء أو التنقل الجغرافي، باستخدام برنامج مخصص مثل ImageJ.