سير عمل التصوير المقطعي بالتبريد الإلكتروني للأنسجة السميكة موضح في حصين الفئران
مارس 27, 2026
يقوم هذا البروتوكول بتوحيد التصوير المقطعي بالإلكترونات التجميدية (cryo-ET) للأنسجة السميكة من خلال دمج التجميد عالي الضغط (HPF) مع طريقة الوافل، ورفع شعاع الأيونات المركز بالتجميد (cryo-FIB)، والاكتساب المتوازي المتماثل مع الجرعة، مما ينتج صفائح رقيقة وعينات مزجاجة بشكل موحد لتحليل ميداني قابل للتكرار في الحصين الفأري.
يركز بحثي على إنشاء سير عمل موحد للتجميد والتبريد لتمكين التحليل البنيوي الميداني للأنسجة السميكة مثل حصين الفأر. تفتقر الطرق الحالية إلى الموثوقية للأنسجة السميكة، لذا يدمج هذا البروتوكول خطوات محسنة للتحليل الموحد. للبدء، ضع قطرة بحجم 10 لتر من محلول السكروز بنسبة 10٪ على سطح زجاجي نظيف.
قم بتفكيك الحصين بسرعة من فأر تم إعدامه حديثا. باستخدام شفرة حلاقة حادة، قم بإزالة قطع صغيرة من الأنسجة بحجم 0.5 إلى 1 مليمتر مكعب. باستخدام عود أسنان أو فرشاة دقيقة، انقل النسيج إلى شبكات دعم النحاس المحضرة داخل حامل التجميد عالي الضغط.
استخدم 2-ميثيلبنتان للحفاظ على رطوبة النسيج وضبط موقعه على الشبكة، مع تقليل الإجهاد الميكانيكي لتجنب تلف الشبكة. ثم غط النسيج والشبكة بقرص من رقائق النحاس بقطر 3 ملم فقط. لإكمال التجميع، ضع حامل التجميد الثاني عالي الضغط، مسطحا للأسفل، في الأعلى لتشكيل شطيرة وافل مغلقة.
وتحقق من معايير التجميد للتأكد من عدم وجود خلل في الآلة. تأكد من أن الوقت الإجمالي من تشريح الأنسجة حتى التجميد لا يتجاوز 90 ثانية. احصل على شبكة ذهبية جديدة ب 300 شبكة لتكون شبكة المستقبل النهائية لإجراء الإخراج.
تحت ميكروسكوب ستيريو في درجة حرارة الغرفة، قم بتثبيت الشبكة بلطف في حلقة أوتوجريد متوافقة مع التجميد مع FIB. ثم خزن الأوتوغرايد المجمع مباشرة في فرن جاف، مع الحفاظ على درجة حرارة تقارب 40 درجة مئوية، لتقليل تراكم الصقيع قبل الاستخدام. أثناء غمر المجموعة باستمرار في النيتروجين السائل، افصل بعناية شبكة TEM المزجاجة عن مكونات تجميع الوافل المحيطة.
باستخدام ملقط بارد مسبقا ذو رؤوس دقيقة، افصل بين حاملين للتجميد عالي الضغط برفق. بعد ذلك، على محطة عمل باردة مسبقا وتحميلها بالتبريد، قم بتركيب شبكة الأنسجة المعزولة في حلقة أوتوغريد ثانية من نوع التجميد التلقائي تحت حماية النيتروجين السائل. قم بتحميل كلا الشبكات التلقائية في الفتحات المخصصة لحاملة عينات النقل بالتجميد.
وجه كل أوتوجريد بحيث يكون شق التفريز متجها للخارج وموضوعا عموديا لتمكين زاوية تشكيل أقل. حافظ على المكوك المحمل بالكامل مغمورا في النيتروجين السائل أو محفوظا في حالة مبردة مسبقا حتى يتم نقله إلى FIB-SEM. قم بتحميل مرحلة العينة في الآلة باستخدام قضيب العينة.
بعد النقل بالتجميد إلى المجهر، انتقل إلى شبكة الأنسجة بتكبير SEM منخفض. ثم قم بتغطية سطح الشبكة بالبلاتين عند 30 مللي أمبير لمدة 15 ثانية لتوفير حماية موصلية. وضع غطاء بلاتيني عضوي معدني بسماكة 0.5 إلى 1.0 ميكرومتر باستخدام نظام حقن الغاز لمدة تقارب 60 ثانية.
ضع طبقة بلاتينية مطلية بالرشاشات النهائية على سطح الشبكة عند 30 ملي أمبير لمدة 15 ثانية. باستخدام صورة شعاع الإلكترونات SEM، انتقل إلى المنطقة المختارة على شبكة الأنسجة. لتوجيه العينة للطحن من الجانب الأمامي، قم بضبط المرحلة إلى دوران حوالي 110 درجات وإمالة 7 درجات لعرض سطح العينة بزاوية مناسبة للوصول إلى شعاع الأيونات.
لتشكيل الخندق، حدد خندقا مستطيلا يحيط بكتلة الأنسجة المستهدفة باستخدام شعاع الأيونات الذي يعمل بجهد 30 كيلوفولت. ابدأ الطحن على مسافة من الكتلة باستخدام تيار مرتفع نسبيا قدره 15 نانو أمبير لتحقيق إزالة سريعة للمواد. عندما تقترب جدران الخندق من الكتلة حتى بضعة ميكرومترات، قلل تيار شعاع الأيون إلى 7 نانوأمبير لتحقيق تحكم أكثر دقة في الطحن.
اترك جانبا من الكتلة ملتصقا بالمادة السائبة لتشكيل لسان احتجاز مؤقت. بالنسبة لكتل الأنسجة التي يقدر بسماكتها أكثر من 20 ميكرومتر، قم بتنفيذ خطوة طحن تحت القطع من الجانب الخلفي لتسهيل الرفع النهائي. قم بتدوير المسرح وضبط الميل للوصول إلى أسفل البلوك.
قم بتشكيل الاتصال السفلي باستخدام شعاع الأيونات المركز بقوة 30 كيلوفولت وتيار 3 نانوأمبير. قم بطحن أسفل الكتلة المعدنية ليتناسب بإحكام مع كتلة العينة. قم بطحن سطح التلامس الدقيق بين العينة وكتلة الذهب لجعل التلامس أكثر إحكاما.
لتثبيت العينة على الإبرة، تأكد من أن كتلة الذهب على اتصال مباشر مع العينة المستهدفة. باستخدام شعاع الأيون المركز عند 30 كيلوفولت و0.5 نانوأمبير، قم بتنفيذ 8 إلى 12 نمط طحن مقطع عرضي متتابع عند الواجهة لربط كتلة الذهب بالعينة. لرفع كتلة الأنسجة، اقطع اللسان المتبقي الذي يربط الكتلة بالعينة الكبيرة باستخدام شعاع الأيونات المركز.
حرك إبرة الميكرو بحذر لرفع كتلة الأنسجة المعزولة بعيدا تماما عن الخندق والشبكة المحيطة. اسحب الإبرة وانقل الكتلة إلى شبكة المستقبل. وجه إبرة الميكرو مانبوليتور إلى شبكة استقبال ذهبية مكونة من 300 شبكة مبردة مسبقا.
خفض الكتلة إلى مربع شبكة مختار. قم بإزالة بلورات الجليد الصغيرة على الشبكة لجعل كتلة الأنسجة والشبكة تلتصق بإحكام أكبر. خفض كتلة النسيج بحيث تلامس الشبكة فقط.
قم بطحن شريحة بسماكة 3 إلى 4 ميكرومتر من الكتلة إلى الفيلم الشبكي باستخدام شعاع الأيون. بعد ذلك، لحام الشريحة بإحكام عن طريق الطحن، باستخدام أنماط مقطع التنظيف على جانبي الوصلة، وأعد تطبيق الطلاء الموصل والواقي على سطح الشبكة كما هو موضح سابقا. بالنسبة لتخفيف الصفيحة، بعد ضبط ميل المسرح، حدد الموضع النهائي لللاميلا ضمن منطقة ناعمة من كتلة الأنسجة.
قم بإجراء طحن منهجي باستخدام تيارات شعاع الأيونات وتعويضات الإمالة الزائدة المحددة في الجدول المعروض. عندما تكون على بعد 1 إلى 2 ميكرومتر من الصفائح، يمكنك طحن خندق تخفيف الإجهاد على بعد حوالي 1.5 ميكرومتر لمنع انحناء أو انحناء الصفائح. بعد تحضير الصفيحة اللاميلية، يلتقط صورا باستخدام المجهر الإلكتروني البارد.
أظهرت كتل الأنسجة التي تمت معالجتها بالتجميد عالي الضغط بطريقة الوافل مظهرا موحدا وشفافا للإلكترون. تم حل التصوير المقطعي المعاد بناؤه الهياكل الميتوكوندرية داخل البيئة الخلوية. تم حل المركبات الجزيئية الكبيرة، مثل الريبوسومات، بوضوح في السيتوبلازم.
كما ظهرت الخصائص الخلوية الهيكلية والمرتبطة بالغشاء ومجمعات المسام النووية في التصوير المقطعي المعاد بناؤه. تم رؤية البنى والخصائص المشبكية، بما في ذلك مخزون الكالسيوم وهياكل غمد الميالين، بوضوح في التصوير الطوغرامي. يتيح هذا البروتوكول للباحثين دراسة البنية الخلوية الخارجية الأصلية مباشرة داخل بيئات الأنسجة المعقدة.
التحدي الأهم في هذا البروتوكول هو تحقيق تزجيج موحد وخالي من الآثار لعينات الأنسجة السميكة. وبعد هذا الإجراء، يمكن للباحثين تحديد المناطق ذات الاهتمام باستخدام تقنيات المجهر المرتبط بالضوء والإلكترونيات أو الوسم، ثم إجراء المتوسط تحت المخطط المقطعي وتحليل البنية لحل المجمعات الجزيئية الكبيرة.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
Overview
This article presents a comprehensive, standardized workflow for cryo-electron tomography (cryo-ET) of thick tissue samples, specifically demonstrated on mouse hippocampus. The protocol integrates rapid high-pressure freezing, precise cryo-focused ion beam (cryo-FIB) milling, and advanced imaging and data processing steps to enable high-resolution, in situ structural analysis of native cellular environments within complex tissues.
Key Study Components
Area of Science
- Structural biology
- Cryo-electron microscopy
- Tissue ultrastructure analysis
Background
- Cryo-ET allows 3D visualization of cellular ultrastructure in a near-native state.
- Application to thick tissues is limited by challenges in vitrification and lamella preparation.
- Existing protocols often lack reproducibility and throughput for complex tissue samples.
- Reliable workflows are needed for in situ analysis of macromolecular complexes within tissues.
Purpose of Study
- To establish a reproducible, end-to-end cryo-ET workflow for thick tissue samples.
- To optimize vitrification and lamella preparation for high-quality imaging.
- To enable high-throughput, artifact-free structural analysis of native tissue environments.
Methods Used
- Rapid dissection and high-pressure freezing (HPF) of tissue using a "waffle" assembly with copper foil.
- Transfer and mounting of tissue onto TEM grids, followed by vitrification within 90 seconds of dissection.
- Cryo-FIB milling for lift-out and thinning of tissue blocks to 120–200 nm lamellae, with over-tilt compensation and stress-relief trenching.
- Standardized conductive coating using sputter platinum and gas injection system (GIS) platinum cap.
- Automated, dose-symmetric tilt-series acquisition using PACEtomo scripts.
- Data processing with AreTomo 3 for motion correction, CTF estimation, alignment, and WBP reconstruction; optional IsoNet for missing-wedge correction.
- Subtomogram averaging and resolution assessment using RELION 4.0.
Main Results
- The workflow consistently produces well-vitrified, uniform lamellae (target thickness 150 ± 40 nm).
- High-throughput tilt-series collection is achieved (typically 5–8 minutes per tilt series).
- Reconstructed tomograms resolve key cellular structures, including mitochondria, ribosomes, cytoskeletal elements, nuclear pore complexes, synaptic features, calcium stores, and myelin sheaths.
- The protocol enables direct visualization and analysis of macromolecular complexes in situ within thick tissue samples.
Conclusions
- This standardized protocol overcomes major challenges in cryo-ET of thick tissues, particularly vitrification and lamella preparation.
- It provides a reproducible, high-throughput route for in situ structural biology studies in complex tissue environments.
- The workflow facilitates detailed analysis of native cellular architecture and macromolecular assemblies directly from tissue.
Frequently Asked Questions
Executive Industry Relevance
High-resolution, in situ structural analysis of thick tissue samples is a critical bottleneck in early discovery and translational research. This standardized cryo-electron tomography (cryo-ET) workflow enables reproducible, artifact-minimized visualization of native cellular architecture directly from complex tissues, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The protocol's throughput and reliability position it as a foundational capability for enterprise-scale structural biology and preclinical model development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct interrogation of macromolecular complexes within native tissue environments.
- Supports mechanistic de-risking by resolving cellular ultrastructure relevant to disease pathways.
- Facilitates functional target validation through high-fidelity visualization of subcellular features.
- Improves predictive confidence for portfolio triage by minimizing sample preparation artifacts.
Screening & Assay Development
- Prepares uniform, electron-transparent lamellae suitable for downstream high-throughput imaging workflows.
- Standardizes sample preparation to ensure reproducibility and quantitative comparability across experiments.
- Enables reliable assessment of compound effects on tissue ultrastructure in screening campaigns.
- Supports platform scalability and reuse for diverse tissue types with minimal adaptation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns structural readouts with disease-relevant tissue models for translational biomarker discovery.
- Provides continuity from discovery-stage mechanistic insights to preclinical validation in complex tissues.
- Reduces risk of late-stage biological failure by enabling early detection of ultrastructural phenotypes.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on direct visualization of target engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow bridges early discovery, lead identification, and preclinical research by enabling robust, high-throughput structural analysis of thick tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification through direct visualization of native macromolecular assemblies.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative lamellae preparation for reliable downstream imaging and analysis.
- Analytics: Provides high-resolution tomograms and subtomogram averages for comparative condition analysis.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and disease-relevant model validation using in situ tissue architecture.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, standardized protocol adaptable across tissue types and research programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible, and scalable sample preparation and imaging workflows.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by reducing late-stage biological risk.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of structurally validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryo-EM, cryo-FIB milling, and high-pressure freezing instrumentation.
- Demands access to advanced analytical infrastructure for automated tilt-series acquisition and data processing.
- Necessitates cross-team standardization of sample handling, vitrification, and lamella preparation protocols.
- Adaptation to other tissue types may require optimization of dissection and freezing parameters.
- Uniform vitrification and artifact minimization are critical for reproducible, high-quality outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:27
High-Pressure Freezing of Thick Tissue for Cryo-Electron Tomography
1:44
Preparation of Receiver and Tissue Grids for Cryo-FIB Lift-Out
4:08
Tissue Block Isolation and Lift-Out
6:56
Block Attachment to the Receiver Grid
7:49
Lamella Thinning
8:36
Results
9:23
Conclusion
