لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع عبر توسع الشيفرة الجينية في الإشريكية القولونية وخلايا الثدييات

طورنا نظام tRNA للساعة/RS لتجاوز قيود التقليد والإنزيمات، مما يتيح دمج لاكتلة الليسين بدقة لدراسة بيولوجيته. يمكن تطبيق هذا البروتوكول لدراسة استقلاب الورم، وظائف الإنزيمات، ومواقع الساعة. للبدء، قم بتحويل مشترك 50 ميكرولتر من خلايا الإشريكيا القولونية DH10B المؤهلة كيميائيا مع حوالي 100 نانوغرام لكل بلازميد مطلوب. حضن خليط التحول على الثلج لمدة 25 دقيقة، ثم صدمه بالحرارة عند 42 درجة مئوية لمدة 45 ثانية.

أعد الأنبوب إلى الثلج لمدة ثلاث دقائق. أضف 350 ميكرولتر من وسط لوريا بيرتاني وهز الأنبوب بقوة بقوة 220 دورة في الدقيقة لمدة ساعة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية. الآن انشر الزراعة الخلوية المحولة على طبق أجار لوريا بيرتاني مع إضافة الأمبيسيلين والكلورامفينيكول.

حضن الطبق عند 37 درجة مئوية لمدة 12 إلى 16 ساعة. ثم اقطف مستعمرة واحدة من الطبق لتطعيم مزرعة بادئ بسعة أربعة ملليتر وحضنها طوال الليل. في اليوم التالي، وسع الزراعة الليلية إلى 400 ملليلتر من وسط لوريا بيرتاني يحتوي على الأمبيسيلين والكلورامفينيكول.

اهز الثقافة بقوة بسرعة 220 دورة في الدقيقة و37 درجة مئوية حتى تصل الكثافة البصرية عند 600 نانومتر إلى ما بين 0.6 و0.8. بعد ذلك، قم بتحفيز الزراعة ب 0.2٪ L-أرابينوز وليسين لاكتيل لاكتيل واحد مليمولر وحضانة عند 30 درجة مئوية و220 دورة في الدقيقة لمدة 16 ساعة. خلايا البذور تنقل صفيحة مكونة من 12 بئر بكثافة واحدة في عشرة إلى قوة خمس خلايا لكل بئر، باستخدام ملليلتر واحد من DMEM.

حضن لمدة 24 ساعة حتى يصل التقاء الخلايا بين 70 و80٪ ثم انتقل إلى النقل الخلوي. لتحضير محلول الحمض النووي المخفف، أضف 0.75 ميكروغرام من البلازميد الذي يحتوي على sfGFP reporter وpNeu-KlacRS بنسبة واحد إلى واحد إلى 38 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع نسبة عالية من الجلوكوز. استخدم الماصة بلطف للأعلى والأسفل أو الدوامة لفترة قصيرة للخلط.

لتحضير مادة التحويل المخفف، أضف 2.25 ميكرولتر من مادة التحويل إلى 38 ميكرولتر من DMEM الخالي من المصل مع نسبة عالية من الجلوكوز. قم بعمل الماصة بلطف للأعلى والأسفل ثلاث إلى أربع مرات لخلط جيدا. أضف فورا مادة التحويل المخفف إلى محلول الحمض النووي المخفف دفعة واحدة.

الآن قم بعمل الماصة للأعلى والأسفل ثلاث إلى أربع مرات لخلط المحتويات وحضن المحلول في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة للسماح بتكون مجمعات النقل والحمض النووي. أضف 50 ميكرولتر من الترانسفيكشن ومركب الحمض النووي بشكل قطري على الوسط في كل بئر وقم بتدوير اللوحة برفق لتجانس الخليج. بعد ست ساعات من النقل، استبدل الوسط ب DMEM جديد يحتوي على ليسين لاكتيل واحد مليمولر وزراعة الخلايا لمدة 24 إلى 48 ساعة.

في الإشريكية القولونية، تم إنتاج hENO1-89Klac بطول كامل عندما أضيف لاكتيل ليسين واحد بميلي مولر إلى وسط النمو. أكد اختبار المناعة وجود hENO1-89Klac كامل الطول باستخدام أجسام مضادة ل-His ومضادة ل-L-lacتيل ليسين. كشف زمن التأين الكهربائي لتحليل الكتلة في الطيران عن قمة سائدة عند 48,178 دالتون، تطابق الكتلة المتوقعة hENO1-89Klac التي تفتقر إلى الميثيونين المبدئي.

أكد مطيافية الكتلة المزدوجة للهضم الثلاثي دمج Klac في الموقع عند البقايا 89 من خلال وجود خريطة كاملة لسلسلة أيونات B&Y إلى الببتيد المعدل. في خلايا HEK293T الثدييات، أظهر المجهر الفلوري تعبيرا قويا ل sfGFP في جميع أنحاء الخلايا عند إضافة Klac لمدة 24 ساعة و48 ساعة، بينما لم يلاحظ أي تألق بدون مكملات Klac. كشفت القياس الخلوي التدفقي أن حوالي 31٪ من الخلايا عبرت عن sfGFP بعد 24 ساعة، وارتفعت إلى حوالي 37٪ بعد 48 ساعة من مكملات Klac.

يتيح هذا البروتوكول دراسة تأثيرات لاكتلة الليسين الخاصة بالموقع على وظيفة البروتين ويسهل قياس النتائج البيولوجية والوظيفية الناتجة. وبعد هذا الإجراء، يمكن للباحثين إجراء دراسات ميكانيكية، وإجراء اختبارات فحص عالية الإنتاجية، وتوليد خطوط خلايا مستقرة لتحليل وظيفي موسع. تهدف دراساتنا المستقبلية إلى تحسين الكفاءة، وتمكين التكامل المستقر، وتطوير تخليق الساعة.